魏 建 昌曹杰 楊 平 曾山崎 王成興 邱旭彬 陳華翠

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞增殖和血管生成素樣蛋白4表達(dá)的影響

魏 建 昌曹杰▲楊 平 曾山崎 王成興 邱旭彬 陳華翠

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

目的研究藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4）表達(dá)的影響，探討藤黃酸可能的抗腫瘤機(jī)制。方法采用不同濃度的藤黃酸干預(yù)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞，分別于12、24、36 h后應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)ANGPTL4蛋白表達(dá)。結(jié)果藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用，該抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性（P＜0.05）。藤黃酸阻滯LOVO細(xì)胞于G2/M期，阻滯作用呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.05）。高濃度藤黃酸能夠誘導(dǎo)LOVO細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。藤黃酸抑制LOVO細(xì)胞ANGPTL4蛋白表達(dá)，ANGPTL4蛋白表達(dá)隨藤黃酸作用濃度的增加而減少（P＜0.05）。結(jié)論藤黃酸能夠抑制結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，阻滯LOVO細(xì)胞于G2/M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制ANGPTL4表達(dá)相關(guān)。

藤黃酸；結(jié)直腸癌；ANGPTL4

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前位居全球惡性腫瘤第3位[1-2]。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因，是結(jié)直腸癌患者治療的一大難題。結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未明確，其中，腫瘤微血管生成在該過(guò)程中有著重要意義[3]。藤黃酸（gambgic acid，GA）是中藥藤黃的活性成分，具有多靶點(diǎn)的抗腫瘤作用，能通過(guò)多種機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用。本課題組前期研究表明，藤黃酸能夠通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和增殖[4-6]。血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）是新發(fā)現(xiàn)的一種分泌蛋白，是血管生成素樣蛋白（angiopoietin-like proteins，ANGPTLs）家族的成員之一，與血管生成、能量代謝及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度藤黃酸作用結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞，研究藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞增殖的影響并檢測(cè)ANGPTL4蛋白表達(dá)，探討藤黃酸可能的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

藤黃酸（98%純度），購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，保存于-20℃冰箱。結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞，貼壁單層生長(zhǎng)，40%集落形成率，100%裸鼠致瘤性，由南京凱基公司供應(yīng)。兔抗人ANGPTL4抗體，購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司。

1.2 方法

1.2.1 LOVO細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RPMI1640培養(yǎng)液中加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LOVO細(xì)胞以1×105個(gè)/孔數(shù)量接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，加入濃度分別為0、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度的藤黃酸溶液，每孔200 μL，各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36 h后，滴加CCK-8液20 μL，孵育1 h，棄上清，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布及凋亡對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LOVO細(xì)胞以每孔1×105個(gè)數(shù)量接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，分別加入0（對(duì)照組）、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度的藤黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心獲取細(xì)胞，PBS液洗滌，70%冷乙醇固定12 h，PBS液清洗去除固定液，離心獲取細(xì)胞，RNA酶反應(yīng)過(guò)夜，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，應(yīng)用ModFit LT 2.0軟件進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)ANGPTL4蛋白表達(dá)分別收集0（對(duì)照組）、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度藤黃酸處理24 h的LOVO細(xì)胞，蛋白裂解液提取蛋白，采用SDSPAGE方法進(jìn)行電泳，每孔50 pg蛋白，100 V恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉2 h，滴加1∶500兔抗人ANGPTL4抗體，搖床振動(dòng)搖勻2 h，PBST溶液洗滌3次，滴加1∶400兔抗羊IgG-HRP，搖床2 h，PBST洗滌3次，滴加ECL溶液進(jìn)行顯色、曝光、拍照、掃描，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析蛋白灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用

不同濃度藤黃酸作用于LOVO細(xì)胞后，呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。藤黃酸濃度為0 mg/L（對(duì)照組）時(shí)，其對(duì)LOVO細(xì)胞基本無(wú)抑制作用，12、24、36 h后抑制率分別為（0.84±1.64）%、（0.98±1.04）%、（1.08±0.68）%；濃度為1.0 mg/L藤黃酸作用LOVO細(xì)胞12、24、36 h后抑制率分別為（8.43±1.62）%、（11.81±1.24）%、（29.30± 1.15）%，與對(duì)照組相比較，抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為2.0 mg/L時(shí)抑制率分別為（36.74±1.38）%、（49.21±1.08）%、（85.35±1.26）%，與對(duì)照組相比較，抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為4.0 mg/L時(shí)抑制率分別為（46.32±1.33）%、（77.92±1.10）%、（98.27±0.74）%，與對(duì)照組相比較，抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用，該抑制作用隨著藤黃酸濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖1。

2.2 藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞細(xì)胞周期構(gòu)成和凋亡水平的影響

藤黃酸干預(yù)LOVO細(xì)胞后，其細(xì)胞周期的構(gòu)成發(fā)生顯著改變。干預(yù)24 h后，藤黃酸濃度為1.0 mg/L時(shí)，G2/M期細(xì)胞分布較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），凋亡率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藤黃酸濃度為2.0 mg/L時(shí)，G2/M期細(xì)胞分布較對(duì)照組明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），凋亡率較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為4.0 mg/L時(shí)，（51.21±2.01）%的LOVO細(xì)胞阻滯于G2/M期，G2/M期細(xì)胞分布較對(duì)照組顯著增加，G0/G1期細(xì)胞分布顯著減少，兩者比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），凋亡率較對(duì)照組顯著增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞ANGPTL4蛋白表達(dá)的影響

0、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度藤黃酸分別處理LOVO細(xì)胞24 h后，相對(duì)分子量45 kD處見(jiàn)ANGPTL4蛋白條帶逐漸變細(xì)，其灰度值分別為（812.00±3.04）、（640.00± 2.30）、（446.00±1.46）、（102.00±0.82）DPI。表明藤黃酸抑制LOVO細(xì)胞ANGPTL4蛋白表達(dá)，且隨著藤黃酸濃度升高，ANGPTL4蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

結(jié)直腸癌是國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前位居全球惡性腫瘤第3位[1-2]。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因，是結(jié)直腸癌患者治療的一大難題。結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未明確，其中，腫瘤微血管生成在該過(guò)程中有著重要意義[3]。

藤黃是治療腫瘤的一種常見(jiàn)中藥，其來(lái)源廣，價(jià)格低，副作用少，藤黃酸是其活性成分。近年研究提示，藤黃酸具有多靶點(diǎn)的抗腫瘤作用，能通過(guò)多種機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用。藤黃酸抗腫瘤作用與常見(jiàn)化療藥物不同，可以選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用。本課題組前期研究表明，藤黃酸能夠通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和增殖[4-6]。

ANGPTL4是一種分泌蛋白，是血管生成素樣蛋白家族成員之一，與血管生成、能量代謝及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。朱洪新等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移及血管生成，促使膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。Le等[10]在腎細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4 mRNA和蛋白表達(dá)增高。Nakayama等[11]發(fā)現(xiàn)，胃腺癌中ANGPTL4表達(dá)增加，表示ANGPTL4可能通過(guò)促進(jìn)微血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供豐富的血液供應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供有利的環(huán)境和條件。該團(tuán)隊(duì)同時(shí)研究結(jié)直腸癌中ANGPTL4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ANGPTL4表達(dá)增高并能夠提高腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12]，但未進(jìn)一步闡述相關(guān)作用機(jī)制。韓杰等[13]利用shRNA干擾大腸癌HT-29細(xì)胞，下調(diào)ANGPTL4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞遷移能力受到抑制，提出其可能的機(jī)制：ANGPTL4相關(guān)信號(hào)通路活性降低，影響肌動(dòng)蛋白快速聚合和解聚，從而抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移。Zhu等[14]研究認(rèn)為，ANGPTL4的促腫瘤作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)和增強(qiáng)由NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，改變O2和H2O2之間的比例，為腫瘤細(xì)胞提供有利的環(huán)境和條件，提高腫瘤細(xì)胞活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力，促使腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用，該抑制作用隨著藤黃酸濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，藤黃酸阻滯LOVO細(xì)胞于G2/M期，表示藤黃酸能夠抑制LOVO細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂[9]，從而抑制LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。隨著藤黃酸作用濃度的升高，G2/M期阻滯比例升高，阻滯作用增強(qiáng)，表明藤黃酸對(duì)LOVO細(xì)胞周期的阻滯作用呈現(xiàn)濃度依賴性。此外，流式細(xì)胞儀結(jié)果還顯示，高濃度藤黃酸能夠誘導(dǎo)LOVO細(xì)胞的凋亡，濃度為1.0 mg/L時(shí)，LOVO細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；濃度為2.0、4.0 mg/L時(shí)，凋亡率較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。然而，LOVO細(xì)胞總體凋亡率較細(xì)胞周期阻滯程度低，提示藤黃酸抑制LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)增殖作用主要與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。

綜上所述，藤黃酸能夠抑制結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)LOVO細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能是阻滯LOVO細(xì)胞于G2/M期，抑制LOVO細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞ANGPTL4蛋白的表達(dá)。藤黃酸是一種極具前景的抗癌藥物，但其確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究和探討。

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Effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cell proliferation and ANGPTL4 expression

WEI JianchangCAO Jie▲YANG PingZENG ShanqiWANG ChengxingQIU XubinCHEN Huacui
Department of Gastrointestinal Surgery,Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangdong Province,Guangzhou510180,China

ObjectiveTo investigate the effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cells proliferation and the expression of ANGPTL4,discuss the antitumor mechanism of gambogic acid.Methods LOVO cells were cultured with different concentrations of gambogic acid for 12,24 and 36 h in vitro.CCK-8 was used to observe the change in the proliferation of LOVO cells.Flow cytometry(FCM)was applied to analyze cell-cycle kinetics and apoptosis of LOVO cells cultured with different concentrations of gambogic acid for 24 h.Western Blot was applied to detect the protein expression of ANGPTL4.ResultsGambogic acid suppressed the proliferation of LOVO cells in a concentration-dependent and time-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid arrested LOVO cells at G2/M stages in a concentration-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid with high concerntration could induce apoptosis of LOVO cells(P＜0.05). Gambogic acid suppressed the expression of ANGPTL4 protein,the level of ANGPTL4 protein decreased as concentration increased（P＜0.05).ConclusionGambogic acid can inhibit the proliferation of LOVO cells,arrest LOVO cells at G2/M stages and induce apoptosis.The mechanism is related to the suppression of ANGPTL4.

Colorectal cancer;Gambogic acid;ANGPTL4

R735.35

A

1673-7210（2015）04（b）-0004-04

2015-01-03本文編輯：程銘）

國(guó)家自然科學(xué)資金資助項(xiàng)目（編號(hào)81272556）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2010B060900016）。

▲通訊作者