宋彥麗，王春娟，王蓬蓮，林金嬉，馬越濤，劉麗，杜萬良，劉改芬

卒中的疾病負(fù)擔(dān)巨大，而且越來越多的研究證明卒中具有明顯的遺傳傾向[1-2]。2003年冰島科學(xué)家Gretarsdottir首次證實(shí)了磷酸二酯酶4D（phosphodiesterase 4D，PDE4D）基因多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與缺血性卒中相關(guān)[3]。此后該基因成為國際學(xué)者研究的熱點(diǎn)，其基因多態(tài)性與不同地區(qū)、不同種族人群缺血性卒中的關(guān)系存在很大的爭議，多數(shù)研究主要關(guān)注PDE4D與卒中發(fā)病的關(guān)系，而PDE4D與卒中預(yù)后相關(guān)性的研究較少[4-7]。PDE4D基因SNP83（rs966221）位點(diǎn)有A、G兩個(gè)等位基因，其中A等位基因是中國人群中的野生型。本研究采用Sequenom Massyarray檢測技術(shù)檢測該位點(diǎn)的基因型情況，探討該位點(diǎn)與缺血性卒中預(yù)后的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 研究對象 本研究連續(xù)入選2009年10月～2011年7月北京天壇神經(jīng)內(nèi)科住院的缺血性卒中患者736例。所有參與者都簽署知情同意書。本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ①臨床診斷明確的新發(fā)急性缺血性卒中患者；②年齡＞18歲；③發(fā)病距就診日期在14 d內(nèi)；④完成顱腦磁共振彌散加權(quán)成像成像（diffusion weighted imaging，DWI）檢查；⑤入院后24 h內(nèi)留取血樣，提取患者白細(xì)胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）；⑥簽署參與研究的知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①無癥狀和體征的靜息性缺血性卒中；②非缺血性卒中的其他腦血管事件如短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic stroke，TIA）、腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）等；③經(jīng)證實(shí)的非腦血管事件；④腦血管事件發(fā)生至就診時(shí)間超過14 d；⑤未完成DWI檢查；⑥24 h內(nèi)未留取血樣的患者；⑦拒絕簽署研究知情同意書。

1.4 臨床資料收集 ①該研究為單中心研究，依據(jù)入排標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)入組發(fā)病14 d內(nèi)的急性缺血性卒中患者。每例患者均通過電子病歷報(bào)告表（electronic Case-Report Form，eCRF）記錄患者的臨床信息，包括人口學(xué)信息、既往史、現(xiàn)病史、用藥史、家族史、體格檢查、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分、改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）評(píng)分等相關(guān)資料；通過檢驗(yàn)系統(tǒng)數(shù)據(jù)平臺(tái)（Lis系統(tǒng)）收集患者的化驗(yàn)信息（包括血脂、血糖、血常規(guī)、超敏C反應(yīng)蛋白、抗心磷脂抗體、紅細(xì)胞沉降率、同型半胱氨酸、免疫相關(guān)指標(biāo)等）；通過影像數(shù)據(jù)平臺(tái)（PACS系統(tǒng)）收集患者影像檢查信息，包括計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、頸部血管超聲、經(jīng)顱多普勒超聲（transcranial Doppler，TCD）、數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、24 h動(dòng)態(tài)心電圖、經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖等。②隨訪：每例患者均由北京天壇醫(yī)院隨訪中心經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的隨訪人員在卒中發(fā)病后3個(gè)月進(jìn)行電話隨訪，隨訪內(nèi)容包括mRS評(píng)分（以1分為界分為預(yù)后良好和預(yù)后不良[8]）、死亡、卒中復(fù)發(fā)、其他血管事件、用藥情況等。本研究的聯(lián)合終點(diǎn)事件定義為卒中復(fù)發(fā)、TIA復(fù)發(fā)、死亡以及其他血管事件。

1.5 基因多態(tài)性檢測 該研究使用Sequenom平臺(tái)自帶的引物設(shè)計(jì)軟件Assay Design進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用Sequenom Massyarray技術(shù)進(jìn)行PDE4D基因SNP83（rs966221）位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示其平均水平，不符合正態(tài)分布則用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）來表示其平均水平；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和構(gòu)成比來表示。計(jì)量資料如果符合正態(tài)分布，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)分析SNP位點(diǎn)基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P≥0.01認(rèn)為樣本來自遺傳平衡的群體，具有較好的代表性。采用Logistic回歸模型分析不同遺傳模型下SNP83基因多態(tài)性與卒中后聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生（復(fù)發(fā)、死亡等聯(lián)合終點(diǎn)事件）和預(yù)后不良（mRS＞1分）的關(guān)聯(lián)，并計(jì)算比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SAS 9.3軟件（SAS Institute Inc，Cary，North Carolina）進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn) 該研究按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)共納入736例缺血性卒中患者，3個(gè)月隨訪時(shí)59例患者失訪，失訪率為8.02%，剩余677例患者的臨床信息見表1。與未發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件的患者相比，發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件的患者年齡較大［（67.02±0.70） vs （59.98±3.35），P＜0.001］，既往心房顫動(dòng)病史比例較高（9.3%vs 3.7%，P=0.048），入院時(shí)NIHSS評(píng)分較高［11（5～16） vs 5（2～9），P＜0.001］。兩組患者在性別、民族、婚姻狀況、居住方式、既往吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病史等方面差異均無顯著性（P＞0.05）。這些患者3個(gè)月隨訪時(shí)mRS評(píng)分中位數(shù)為1分（0～4分），其中預(yù)后良好（mRS≤1分）的患者330例，占48.9%。

2.2 SNP83位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布情況 該位點(diǎn)有2例患者未檢測出基因型，檢出率為99.70%。由表2可見，該位點(diǎn)的最小等位基因頻率（minor allel frequency，MAF）為21%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，該位點(diǎn)符合遺傳平衡定律即Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.770，PHEW=0.380）。與未發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件患者相比，發(fā)生聯(lián)合終點(diǎn)事件患者中AG+GG基因型的比例較高，且差異具有顯著性（50.0% vs 36.7%，P=0.007）。而AG+GG基因型在預(yù)后良好和預(yù)后不良患者中的分布差異無顯著性（38.8% vs 36.8%，P=0.787）。

2.3 SNP83位點(diǎn)基因多態(tài)性與缺血性卒中預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)以上基因型分布情況，在加性模型（AA vs AG vs GG）和顯性模型（AG+GG vs AA）下分析SNP83位點(diǎn)與卒中預(yù)后的相關(guān)性。由表3可見，在加性模型下，經(jīng)年齡、既往心房顫動(dòng)病史和入院時(shí)NIHSS評(píng)分調(diào)整后多因素Logistic分析未發(fā)現(xiàn)SNP83位點(diǎn)與聯(lián)合終點(diǎn)事件的發(fā)生相關(guān)（OR 1.29，95%CI 0.82～2.05）。而該位點(diǎn)在顯性模型下經(jīng)多因素調(diào)整后與聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生相關(guān)，AG+GG基因型攜帶者聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型攜帶者的1.84倍（95%CI 1.04～3.26），因此G等位基因是卒中發(fā)病危險(xiǎn)等位基因（表3）。同時(shí)，按照國際公認(rèn)的急性卒中治療低分子肝素試驗(yàn)病因分型法（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[9]，對卒中不同亞型進(jìn)行分層分析，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與不同卒中亞型后聯(lián)合終點(diǎn)事件的發(fā)生相關(guān)。在加性和顯性模型下，經(jīng)年齡、既往心房顫動(dòng)病史和入院時(shí)NIHSS評(píng)分調(diào)整后Logistic分析均未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與卒中預(yù)后不良的相關(guān)性，并且也未發(fā)現(xiàn)其與不同亞型卒中預(yù)后不良的相關(guān)性（表4）。

表1 有無聯(lián)合終點(diǎn)事件兩組患者基線信息特征

表2 SNP83位點(diǎn)基因型在不同組別中的分布情況

表3 SNP83位點(diǎn)基因多態(tài)性與卒中及其不同亞型聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生的相關(guān)性

3 討論

PDE4D基因位于人類染色體5q12上，長度大約為1.6 Mb，至少含21個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，是一類能特異性水解環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），使其轉(zhuǎn)變成失活性的單核苷酸的關(guān)鍵酶，這是cAMP和cGMP降解的唯一途徑[10]。cAMP廣泛存在于體內(nèi)各種細(xì)胞中，包括血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理反應(yīng)的調(diào)控中起著重要作用。研究認(rèn)為PDE4D的表達(dá)增加可導(dǎo)致cAMP的活性降低，進(jìn)而引起血管平滑肌細(xì)胞增生和遷移以及血管受損處局部炎癥反應(yīng)加劇，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊的易損性增加[11-12]。

目前關(guān)于PDE4D基因與缺血性卒中發(fā)病的相關(guān)性的研究較多。2003年來自冰島人群的研究[3]，表明PDE4D基因的SNP41、SNP45、SNP56、SNP83、SNP87、SNP89與缺血性卒中，尤其是頸動(dòng)脈源性和心源性卒中明顯相關(guān)。Saleheen等[13]在包括200例缺血性卒中患者和250例對照的巴基斯坦人群中驗(yàn)證了該基因的SNP83（rs966221）與缺血性卒中的相關(guān)性。同時(shí)Yadav等[14]在南亞人群中進(jìn)行的meta分析，也發(fā)現(xiàn)PDE4D基因的SNP83位點(diǎn)與缺血性卒中發(fā)病相關(guān)。但Kuhlenbumer等[15]在德國人群中的研究未發(fā)現(xiàn)PDE4D基因與缺血性卒中的關(guān)聯(lián)。Lovkvist等[16]在瑞典西部和南部人群進(jìn)行的meta分析，亦未發(fā)現(xiàn)PDE4D基因SNP45位點(diǎn)與缺血性卒中的相關(guān)性。可見目前研究發(fā)現(xiàn)，PDE4D基因多態(tài)性與缺血性卒中的相關(guān)性在不同地區(qū)、不同人群中的結(jié)果不一致，甚至是相反的[4，17-19]，這可能與不同地區(qū)、不同種族人群基因分布情況的差異性有關(guān)。

表4 SNP83位點(diǎn)基因多態(tài)性與卒中及其不同亞型預(yù)后不良的相關(guān)性

He Ying等[20]在中國河南人群中研究該基因與中國人群缺血性卒中的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PDE4D基因的SNP87（rs918592）與該人群缺血性卒中相關(guān)（OR 1.87，95%CI 1.25～2.80），尤其是男性（OR 2.13，95%CI 1.25～3.63）。同時(shí)，他們在中國年輕漢族人群（18～45歲）中進(jìn)行的病例對照研究[21]，顯示該位點(diǎn)的A等位基因和AA基因型明顯增加中國年輕人群卒中的風(fēng)險(xiǎn)（調(diào)整OR，95%CI分別為1.45，1.10～1.91；2.19，1.23～3.90）；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該基因位點(diǎn)的rs2910829的T等位基因和TT基因型與中國年輕人群缺血性卒中的發(fā)生明顯相關(guān)（調(diào)整OR，95%CI分別為2.75，1.97～3.84；6.67，2.58～17.22）。但這兩項(xiàng)研究都未按照TOAST分型進(jìn)行亞型分析。Shao等[22]在中國西南地區(qū)對459例卒中患者和462例健康對照人群進(jìn)行的研究并沒有發(fā)現(xiàn)SNP45、SNP83、SNP87與缺血性卒中的關(guān)聯(lián)（OR和95%CI分別為1.002，0.99～1.01；0.87，0.69～1.10；0.93，0.73～1.19），也未發(fā)現(xiàn)這些基因與按照TOAST分型的不同卒中亞型的相關(guān)性。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在中國人群中與缺血性卒中的相關(guān)性，Liu等[6]對中國人群研究的meta分析發(fā)現(xiàn)SNP83在顯性和隱性模型下均與缺血性卒中發(fā)生相關(guān)，并且亞型分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中的相關(guān)性明顯，這與最近Yan Yan等[5]的meta分析結(jié)果是一致的。在此基礎(chǔ)上，本研究探索了PDE4D基因的SNP83位點(diǎn)與缺血性卒中預(yù)后（復(fù)發(fā)、死亡等聯(lián)合終點(diǎn)事件）的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的AG+GG基因型與缺血性卒中后聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生相關(guān)（調(diào)整OR 1.95，95%CI 1.10～3.47）。由于基因與卒中不同亞型的遺傳度是不同的[23-24]，因此對卒中亞型進(jìn)行了分層分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)AG+GG基因型可能與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中后聯(lián)合終點(diǎn)事件的發(fā)生相關(guān)（OR 2.10，95%CI 0.95～4.67），但差異無顯著性，這可能與本研究樣本量不夠大有關(guān)，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)探討。該研究亦未發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)與小動(dòng)脈閉塞性卒中和心源性卒中預(yù)后相關(guān)，這可能是由于該研究的樣本量較小，導(dǎo)致某些基因型在亞組的分布較少而影響研究結(jié)果，也可能因?yàn)樽渲胁煌瑏喰偷陌l(fā)病機(jī)制不同所致[9，25]，這有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)PDE4D基因SNP83位點(diǎn)與缺血性卒中預(yù)后相關(guān)，這將為卒中的預(yù)防探索新的預(yù)防、診治方案提供思路。但由于該研究為單中心研究，且樣本量有限，導(dǎo)致某些基因型頻率較少，因此有待大樣本、多中心的研究來進(jìn)一步證實(shí)，以便得出更可靠的結(jié)論。

1 Meschia JF, Worrall BB, Rich SS. Genetic susceptibility to ischemic stroke[J]. Nat Rev Neurol, 2011, 7：369-378.

2 樊東升. 卒中的遺傳因素[J]. 中國卒中雜志, 2012, 7：83-85.

3 Gretarsdottir S, Thorleifsson G, Reynisdottir ST, et al.The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke[J]. Nat Genet, 2003, 35：131-138.

4 Yoon D, Park SK, Kang D, et al. Meta-analysis of homogeneous subgroups reveals association between PDE4D gene variants and ischemic stroke[J].Neuroepidemiology, 2011, 36：213-222.

5 Yan Y, Luo XP, Zhang JL, et al. Association between phosphodiesterase 4D polymorphism SNP83 and ischemic stroke[J]. J Neurol Sci, 2014, 338：3-11.

6 Liu X, Zhu R, Li L, et al. Genetic polymorphism in PDE4D gene and risk of ischemic stroke in Chinese population：a meta-analysis[J]. PLoS One, 2013,8：e66374.

7 宋彥麗, 蔡金樂, 潘岳松, 等. 缺血性卒中的遺傳流行病學(xué)研究[J]. 中國卒中雜志, 2014, 9：246-251.

8 Saposnik G, Guzik AK, Reeves M, et al. Stroke prognostication using age and NIH Stroke Scale：SPAN-100[J]. Neurology, 2013, 80：21-28.

9 Adams HP Jr, Bendixen BH, Kappelle LJ, et al. Classification of subtype of acute ischemic stroke. Definitions for use in a multicenter clinical trial. TOAST. Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment[J]. Stroke, 1993, 24：35-41.

10 Houslay MD, Adams DR. PDE4 cAMP phosphodiesterases：modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desensitization and compartmentalization[J]. Biochemical J, 2003, 370：1-18.

11 Liu H, Palmer D, Jimmo SL, et al. Expression of phosphodiesterase 4D (PDE4D) is regulated by both the cyclic AMP-dependent protein kinase and mitogenactivated protein kinase signaling pathways. A potential mechanism allowing for the coordinated regulation of PDE4D activity and expression in cells[J]. J Biol Chem,2000, 275：26615-26624.

12 杜合賓. 磷酸二酯酶4D基因與缺血性腦卒中的研究進(jìn)展[J]. 中華腦血管病雜志(電子版), 2013, 7：32-35.

13 Saleheen D, Bukhari S, Haider SR, et al. Association of phosphodiesterase 4D gene with ischemic stroke in a Pakistani population[J]. Stroke, 2005, 36：2275-2277.

14 Yadav S, Hasan N, Marjot T, et al. Detailed analysis of gene polymorphisms associated with ischemic stroke in South Asians[J]. PLoS One, 2013, 8：e57305.

15 Kuhlenb?umer G, Berger K, Huge A, et al.Evaluation of single nucleotide polymorphisms in the phosphodiesterase 4D gene (PDE4D) and their association with ischaemic stroke in a large German cohort[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2006, 77：521-524.

16 Lovkvist H, Olsson S, H?glund P, et al. A large-sample assessment of possible association between ischaemic stroke and rs12188950 in the PDE4D gene[J]. Eur J Hum Genet, 2012, 20：783-789.

17 Woo D, Kaushal R, Kissela B, et al. Association of phosphodiesterase 4D with ischemic stroke - A population-based case-control study[J]. Stroke, 2006,37：371-376.

18 Munshi A, Roy S, Thangaraj K, et al. Association of SNP41, SNP56 and a novel SNP in PDE4D gene with stroke and its subtypes[J]. Gene, 2012, 506：31-35.

19 Milton AG, Aykanat VM, Hamilton-Bruce MA, et al.Association of the phosphodiesterase 4D (PDE4D)gene and cardioembolic stroke in an Australian cohort[J]. Int J Stroke, 2011, 6：480-486.

20 He Y, Bai J Y, Song B, et al. Sex-dependent association of phosphodiesterase 4D gene polymorphisms with ischemic stroke in Henan Han population[J]. Chin Med J (Engl), 2012, 125：2255-2259.

21 He Y, Yang DZ, Yu H, et al. Genetic variants of phosphodiesterase 4D gene are associated with an enhanced risk for ischemic stroke in young Chinese population[J]. Neurol India, 2013, 61 ：21-25.

22 Shao M. Ischemic stroke risk in a southeastern Chinese population：Insights from 5-lipoxygenase activating protein and phosphodiesterase 4D single-nucleotide polymorphisms [EB/OL] (2013-04-25) (2014-12-20).http：//linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0929-6646(13)00433-6.

23 Bevan S, Traylor M, Adib-Samii P, et al. Genetic heritability of ischemic stroke and the contribution of previously reported candidate gene and genomewide associations[J]. Stroke, 2012, 43：3161-3167.

24 Traylor M, Farrall M, Holliday EG, et al. Genetic risk factors for ischaemic stroke and its subtypes (the METASTROKE collaboration)：a meta-analysis of genome-wide association studies[J]. Lancet Neurol,2012, 11：951-962.

25 Gao S, Wang Y J, Xu AD, et al. Chinese ischemic stroke subclassification[J]. Front Neurol, 2011, 2：6.

【點(diǎn)睛】

該文章研究PDE4D基因SNP83多態(tài)性與缺血性卒中預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其AG/GG基因型與卒中后聯(lián)合終點(diǎn)事件發(fā)生相關(guān)。