楠迪，郭淮蓮，何其華，宋江曼

慢性腦缺血可導(dǎo)致腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細(xì)胞增生等病理改變，與血管性癡呆、阿爾茨海默病、Bingswanger病等緊密相關(guān)[1-2]。慢性腦缺血后腦血管形態(tài)學(xué)改變已引起廣泛關(guān)注[3]。以往對腦缺血后血管形態(tài)學(xué)改變的研究多采用免疫組化染色等方法觀察血管[3]，但該方法不能反映活體血管情況。近年來，有學(xué)者通過顱窗觀察腦缺血后腦血管的改變[4]，該方法可以活體動態(tài)觀察腦血管變化。利用封閉式顱窗活體動態(tài)觀察腦缺血后血管變化的研究國內(nèi)尚未見報道。本研究旨在利用封閉式顱窗對小鼠慢性腦缺血后皮層血管變化進(jìn)行活體動態(tài)觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性STOCK Tg（Tie2-GFP）287Sato/J小鼠，購自美國Jackson實驗室。共7只，8～12周齡，體重（25±5）g。本研究獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物倫理審查委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 自酸蝕粘結(jié)劑（Heraeus Kulzer，德國）；Luxaflow流動樹脂（DMG，德國）；2.5%水合氯醛。牙科鉆（STRONG 207A，Seashin，韓國）；體視顯微鏡（SZXXTWZI，北京泰克匯光）；激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5 Confocol，Leica，德國）；體溫保持裝置（BWT-100A，BRC，日本）。

1.3 顱窗制備 小鼠用2.5%水合氯醛（0.35 g/kg體重）腹腔注射麻醉，置于37℃保溫墊上。體視顯微鏡下剪開小鼠左側(cè)顱骨表面皮膚，用牙科水泥將一金屬棒固定在小鼠顱骨上，再借金屬棒將小鼠頭部固定于自制頭架上。用牙科鉆在左側(cè)顱骨（冠狀縫后2.5 mm，矢狀縫左2.5 mm）鉆一直徑約3 mm的圓孔，保持硬腦膜完整。直徑3 mm的圓形玻片覆蓋暴露的腦表面，用牙科水泥將圓形玻片與周圍顱骨固定，制成封閉式顱窗[5]。小鼠麻醉蘇醒后放回鼠籠，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 慢性腦缺血模型的建立 顱窗制成2 d后，利用激光共聚焦顯微鏡經(jīng)顱窗進(jìn)行第1次皮層血管觀察，當(dāng)日開始制作腦缺血模型（D0）。采用左側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎結(jié)合右側(cè)頸總動脈隔日短暫結(jié)扎的改良慢性腦缺血模型。

在D0將小鼠用2.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定于37℃保溫墊上，取頸部正中切口，剪開淺筋膜，鈍性分離暴露左側(cè)頸總動脈，用4-0絲線永久結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠常規(guī)飼養(yǎng)。3 d后（D3）再次麻醉小鼠，鈍性分離右側(cè)頸總動脈，4-0絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈10 min后松解絲線恢復(fù)血流，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠飼養(yǎng)。此后2 d（D5）再次右側(cè)頸總動脈結(jié)扎10 min后恢復(fù)血流，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠飼養(yǎng)。每次術(shù)后給予適量慶大霉素。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察皮層血管 分別于左側(cè)頸總動脈結(jié)扎前（D0）及左側(cè)頸總動脈結(jié)扎后7 d（D7），利用激光共聚焦顯微鏡通過顱窗觀察皮層血管。

已制備顱窗的小鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部固定于自制小鼠頭架上。激光共聚焦顯微鏡獲取活體腦血管圖像。掃描參數(shù)：激發(fā)光波長（488 nm），10×物鏡，掃描厚度2.0 μm。使用LAS AF操作軟件，在Z軸進(jìn)行連續(xù)掃描，掃描深度為皮層表面以下100 μm內(nèi)。每個小鼠顱窗在10倍鏡下掃描后，選取兩個感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），再40倍鏡下分別掃描選定的2個ROI。分別在D0和D7對同一ROI進(jìn)行激光共聚焦掃描，比較腦缺血前后皮層血管變化。D0或D7顱窗模糊者剔除。

1.5.1 毛細(xì)血管密度與直徑測量 本研究中毛細(xì)血管定義為直徑＜8 μm的血管[6]。

毛細(xì)血管密度定義為每個ROI內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)目[5]。

毛細(xì)血管直徑測量：每個ROI隨機取3支毛細(xì)血管，每支毛細(xì)血管取10個不同位點測量直徑，取其平均代表該毛細(xì)血管直徑[7]。3支毛細(xì)血管直徑的平均值作為該ROI毛細(xì)血管直徑。

毛細(xì)血管又分為分支毛細(xì)血管、網(wǎng)狀毛細(xì)血管、集合毛細(xì)血管及細(xì)動靜脈直通支[8-9]，分別對各類毛細(xì)血管進(jìn)行測量。各類毛細(xì)血管的劃分標(biāo)準(zhǔn)為：網(wǎng)狀毛細(xì)血管：互相吻合呈網(wǎng)狀，走行彎曲，柔軟，圓滑；分支毛細(xì)血管：位于網(wǎng)狀毛細(xì)血管上游，細(xì)動脈下游，管徑細(xì)，走行直；集合毛細(xì)血管：數(shù)個網(wǎng)狀毛細(xì)血管匯集而成，管徑較前粗，彎曲，途徑較短；細(xì)動靜脈直通支：細(xì)動脈與細(xì)靜脈間的直接通路[8]。

1.5.2 細(xì)動脈及細(xì)靜脈直徑測量 細(xì)動脈為小動脈的進(jìn)一步分支，直徑15～30 μm，管壁較厚，走行較直。細(xì)靜脈定義為分段匯集多個毛細(xì)血管，直徑15～50 μm，管壁較薄，走行彎曲[8]。

細(xì)動脈和細(xì)靜脈直徑測量：測同一血管上10個不同位點的直徑，取其平均值為該血管直徑。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，Graph Pad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間比較用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。使用LAS AF軟件進(jìn)行血管直徑測量與計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血后毛細(xì)血管直徑的改變 缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）毛細(xì)血管直徑分別是（6.62±0.75）μm 和（12.50±3.29）μm。D7毛細(xì)血管直徑較D0毛細(xì)血管直徑明顯擴大（t=6.415、P＜0.001），差異具有顯著性（圖1）。

2.2 腦缺血后毛細(xì)血管密度觀察 腦缺血前（D0）和腦缺血后7 d（D7），毛細(xì)血管密度分別為每ROI（11.67±1.72）個和每ROI（11.08±2.06）個，差異無顯著性（t=1.681、P=0.0583）（圖1）。

2.3 腦缺血后不同種類毛細(xì)血管直徑的改變對分支毛細(xì)血管、集合毛細(xì)血管、網(wǎng)狀毛細(xì)血管以及細(xì)動靜脈直通支直徑的測量結(jié)果見表1。

2.4 腦缺血后皮層細(xì)動脈與細(xì)靜脈直徑變化細(xì)動脈直徑在D0（缺血前）和D7（缺血后7 d）時分別是（12.71±2.10）μm和（13.20±3.09）μm（t=0.5533、P=0.2947）。與D0相比，D7時細(xì)動脈直徑增加了3.85%，差異無顯著性。D7時未觀察到細(xì)動脈有新生血管或出芽改變（圖2）。

細(xì)靜脈直徑在D0和D7時分別為（19.59±8.74）μm和（24.81±6.25）μm（t=3.060、P=0.0054）。與D0相比，D7時細(xì)靜脈直徑增加了26.65%，差異有顯著性。腦缺血后7 d時（D7）觀察到細(xì)靜脈走行迂曲，管壁變薄（圖2）。

表1 各類毛細(xì)血管直徑D0與D7比較（s）（μm）

表1 各類毛細(xì)血管直徑D0與D7比較（s）（μm）

注：細(xì)動靜脈直通支、網(wǎng)狀毛細(xì)血管：n=7，分支毛細(xì)血管、集合毛細(xì)血管：n=9

D0 D7 t P分支毛細(xì)血管 6.33 0.94 12.36 3.20 5.453 0.0003集合毛細(xì)血管 6.87 1.10 12.37 2.78 6.203 0.0001網(wǎng)狀毛細(xì)血管 6.37 0.52 11.41 3.10 4.168 0.0029細(xì)動靜脈直通支 6.35 0.92 13.91 6.17 3.138 0.0101

圖1 同一小鼠缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）同一ROI內(nèi)血管直徑與密度變化注：圖A、C、E分別為D0時顱窗影像、10×血管影像及40×血管影像（ROI）；B、D、F分別為D7時的顱窗影像、10×血管影像及40×血管影像（ROI）。圖示腦缺血后7 d（圖F）與缺血前（圖E）相比毛細(xì)血管直徑明顯擴張，毛細(xì)血管密度無明顯變化。c：毛細(xì)血管；ROI：感興趣區(qū)域

2.5 血管重構(gòu) 比較缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）相同區(qū)域皮層血管，發(fā)現(xiàn)缺血7 d后并未見到明顯新生血管或血管生芽。但是，在低倍鏡下可見小動靜脈走行改變，管徑擴大，小靜脈間吻合支的開放（圖3，紅色箭頭）。在高倍鏡下，可見毛細(xì)血管走行改變（圖3，白色箭頭）。

3 討論

腦缺血后血管形態(tài)學(xué)研究，以前多采用腦組織切片染色方法顯示血管[3]，該方法不能反映活體血管情況。近年來，小鼠封閉式顱窗已成為一種活體觀察腦血管的獨特工具，制備封閉式顱窗的小鼠可長期存活，顱窗內(nèi)血管可反復(fù)觀察，適宜于研究血管的動態(tài)變化[10-11]。Tomita及Toriumi等應(yīng)用封閉式顱窗對小鼠大腦皮層血流及血管形態(tài)變化進(jìn)行了長期觀察[10，12]。本研究中，我們應(yīng)用小鼠封閉式顱窗技術(shù)觀察了腦缺血后皮層血管形態(tài)的變化，國內(nèi)尚未見到相關(guān)報道。

雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎和單側(cè)頸總動脈結(jié)扎均為較常用的慢性腦缺血模型[13-14]。雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎模型多用于大鼠慢性腦缺血研究[13]。因大鼠前循環(huán)與后循環(huán)交通支發(fā)達(dá)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，其腦血流量可經(jīng)椎動脈與Willis環(huán)代償。小鼠的交通支不發(fā)達(dá)，小鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法死亡率高，因此單側(cè)頸總動脈結(jié)扎制備小鼠慢性腦缺血模型較普及[14]。在前期的實驗中我們發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后小鼠3 h內(nèi)死亡率為100%。本研究采用左側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎結(jié)合右側(cè)頸總動脈隔日短暫結(jié)扎方法制作小鼠慢性腦缺血模型，腦缺血程度較單側(cè)頸總動脈結(jié)扎重，小鼠可存活（結(jié)果另文發(fā)表）。

圖2 腦缺血前后細(xì)動脈和細(xì)靜脈的變化，40×注：圖中可見腦缺血后細(xì)靜脈直徑增加，走行迂曲；細(xì)動脈直徑無明顯變化。圖A為缺血前（D0），圖B為缺血后（D7）。a：細(xì)動脈；c：毛細(xì)血管；v：細(xì)靜脈

圖3 腦缺血后血管重構(gòu)注：圖A、B分別為同一顱窗缺血前及缺血后7 d時顱窗影像，紅色箭頭示吻合支開放。圖C、D分別為同一ROI缺血前及缺血后7 d時血管影像（40×），白色箭頭示毛細(xì)血管走行改變。ROI：感興趣區(qū)域

利用激光共聚焦顯微鏡和封閉式顱窗技術(shù)，本研究觀察到慢性腦缺血7 d后毛細(xì)血管直徑明顯擴張，提示毛細(xì)血管擴張可能是慢性腦缺血后腦血流恢復(fù)的機制之一。Guo等[5]研究也發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血14 d后皮層毛細(xì)血管擴張，本研究結(jié)果與之一致。

Guo[5]及Tajima等[15]分別觀察了小鼠單側(cè)頸總動脈結(jié)扎后14 d以及28 d皮層表面以下100 μm以及300 μm血管，未見到血管新生或出芽。Yoshihara等利用光照法制造小鼠局灶性腦缺血模型，觀察皮層表面以下300 μm內(nèi)血管，缺血后7～28 d未發(fā)現(xiàn)血管新生或出芽改變[7]。不過，Masamoto等對慢性缺氧小鼠的研究中，觀察到皮層毛細(xì)血管出芽及新生現(xiàn)象，觀察深度為皮層表面以下300～800 μm[16-17]。本研究未觀察到腦缺血后血管新生現(xiàn)象，與Guo[5]、Tajima[14]及Yoshihara[7]等的研究結(jié)果一致，與Masamoto[16-17]等的研究結(jié)果不同。腦缺血后腦內(nèi)是否發(fā)生血管新生各家報道不同，考慮與觀察深度及缺血時間不同有關(guān)：Guo、Tajima、Yoshihara和Masamoto的缺血時間分別為14 d、28 d、7～28 d及14～28 d，觀察深度分別為皮層表面以下100 μm以內(nèi)、300 μm以內(nèi)、300 μm以內(nèi)及300～800 μm[5，7，15-17]。腦缺血后腦內(nèi)是否發(fā)生血管新生仍需進(jìn)一步研究證實。

在微循環(huán)中血液從動脈到靜脈的流動有3條通路：①血流從細(xì)動脈向分支毛細(xì)血管、網(wǎng)狀毛細(xì)血管、集合毛細(xì)血管、細(xì)靜脈方向流動；②血流從細(xì)動脈向分支毛細(xì)血管、毛細(xì)血管直通支、集合毛細(xì)血管、細(xì)靜脈方向流動；③血流從細(xì)動脈向動靜脈短路支、細(xì)靜脈方向流動[8]。本研究觀察到腦缺血后連接細(xì)動靜脈的動靜脈直通支較其他種類毛細(xì)血管擴張明顯，同時部分網(wǎng)狀毛細(xì)血管分支出現(xiàn)狹窄，變細(xì)，甚至消失的現(xiàn)象。這些改變可能為毛細(xì)血管單元在腦血流減少時發(fā)生血管重構(gòu)的動態(tài)過程。

本研究首次觀察了腦缺血后毛細(xì)血管前后的細(xì)動靜脈的直徑變化，結(jié)果顯示，慢性腦缺血7 d后，細(xì)動脈與細(xì)靜脈直徑分別增加了3.85%和26.65%，提示腦缺血后細(xì)靜脈擴張較細(xì)動脈明顯。

Tajima等[15]發(fā)現(xiàn)小鼠慢性腦缺血時細(xì)動脈對腦血流以及血壓的調(diào)節(jié)起到主要作用。Joseph等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦血流阻力的改變與血管直徑相關(guān)，動脈擴張時阻力降低；動脈血流阻力下降時，靜脈的順應(yīng)性緩慢增高。因此作者推測，當(dāng)腦灌注壓降低時，細(xì)動脈發(fā)生擴張以減小血管阻力，調(diào)節(jié)腦血流量，而細(xì)靜脈在細(xì)動脈擴張后順應(yīng)性增強，也發(fā)生擴張性改變。由于細(xì)靜脈的管壁較薄，在相同的缺血條件下，擴張較細(xì)動脈更顯著。

由于本研究存在觀察時間偏短，觀察皮層深度有限等不足，今后有必要延長腦缺血時間并增加觀察深度進(jìn)一步研究。

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【點睛】

本研究通過慢性腦缺血模型發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血后皮層血管發(fā)生毛細(xì)血管擴張（細(xì)動靜脈直通支擴張最為明顯）、細(xì)靜脈擴張等改變，上述改變可能有助于調(diào)節(jié)腦血流量。