■ 葉 滔 楊靜美 閆 凱 馮 蓓 逯佩鳳 孫丹丹 周玉巖

（1.廣東海納川生物科技股份有限公司，廣東佛山528515；2.廣東省獸藥與飼料添加劑工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東佛山528515；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510225）

防御素（defensin）是廣泛存在于生物體中的一類內(nèi)源性抗菌肽（antibacterial peptide），在一定誘導(dǎo)條件下，由宿主細(xì)胞特定編碼基因產(chǎn)生的對抗外源性病原微生物的小分子肽類活性物質(zhì)。它具有廣泛的殺菌活性、細(xì)胞毒性和免疫趨化活性，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。防御素作用機(jī)理獨(dú)特，它主要作用于病原菌的細(xì)胞膜，因此不易產(chǎn)生耐藥性。另外，研究發(fā)現(xiàn)，防御素還可以作為一種效應(yīng)分子，激活和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤功能，有望在抵御病原菌感染中顯示巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景[2]。

菌絲霉素（Plectasin）是Mygind等（2005）研究小組通過篩查腐生子囊菌（the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella）分泌蛋白的cDNA庫，從中找出一些與無脊柱動物防御素序列高度相似的片段，并篩選分離出來的首例真菌防御素[3]。防御素新藥研發(fā)工作一直進(jìn)展緩慢，主要障礙就是它們在大規(guī)模生產(chǎn)時成本過高。Plectasin的發(fā)現(xiàn)打破了一直局限在高等生物，如哺乳動物、昆蟲和植物中分離防御素的現(xiàn)狀，將防御素的來源拓展到具有廣闊開發(fā)前景的低等生物真菌中，從真菌中提取防御素獲得成功，必將大幅降低防御素類抗菌藥物的研究和生產(chǎn)成本，從而加速這類新型抗菌藥物的開發(fā)和應(yīng)用，具有重要意義[2]。

圖1 Plectasin與幾種無脊椎動物防御素的相似性

目前制備大量的防御素是研究和應(yīng)用的前提，其主要途徑有三個：①天然提??；②化學(xué)合成；③基因工程表達(dá)技術(shù)。前兩種方法工藝復(fù)雜、成本高，只能滿足研究所需要的樣品量，難以工業(yè)化生產(chǎn)?；蚬こ瘫磉_(dá)技術(shù)可以用于表達(dá)重組肽，且具有低成本、表達(dá)產(chǎn)物活性高的優(yōu)勢，是目前獲取大量外源蛋白的有效方法。因此，本研究采用基因工程技術(shù)，嘗試在畢赤酵母中通過組成型分泌到胞外的方式表達(dá)重組肽菌絲霉素NZ2114，并進(jìn)行重組肽菌絲霉素NZ2114表達(dá)的50 L發(fā)酵罐規(guī)模中試研究，研究其體外抗菌活性鑒定，為其在規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌絲霉素NZ2114基因，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

載體pPicZα，由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心惠贈。

畢赤酵母GS115，由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心惠贈。

受試菌：金黃色葡萄球菌CMCC26003，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈。

MHB培養(yǎng)基：MHB肉湯培養(yǎng)基21 g溶于1 L蒸餾水中，充分溶解后，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB瓊脂培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。配置LB固體培養(yǎng)基時，加入1.5%的瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至700 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，添加滅菌的10%甘油100 ml，13.4%無氨基酸酵母氮源（YNB）100 ml，0.02%生物素2 ml，1 mol/l磷酸緩沖液pH值6.0 100 ml。

BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至700 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，添加滅菌的5%甲醇100 ml，13.4%無氨基酸酵母氮源YNB 100 ml，0.02%生物素2 ml，1 mol/l pH值6.0磷酸緩沖液100 ml。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至900 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后添加過濾滅菌的20%葡萄糖100 ml。

考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

電泳系統(tǒng)：XCell SureLock?Mini-Cell蛋白垂直電泳槽（美國生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

NZ2114蛋白序列如下：

抗菌肽Plectasin：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY

菌絲霉素NZ2114：GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY

根據(jù)蛋白編碼序列，設(shè)計(jì)相對應(yīng)畢赤酵母的酵母偏愛性密碼子，提交生物公司合成。將合成的NZ2114基因克隆到pUC57中，用XhoI、AvrII雙酶切后，將NZ2114基因插入畢赤酵母表達(dá)載體pPicZα，位于α因子信號肽突變體序列的下游，得到重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114，并對該質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切及測序鑒定。將重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114經(jīng)PmeI酶切后，電轉(zhuǎn)到畢赤酵母 GS115 中，用含 500～1 000 μg/ml Zeocin(博萊霉素)的YPD培養(yǎng)基篩選，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，PCR鑒定篩選多拷貝陽性轉(zhuǎn)化子[4]。

1.2.2 菌絲霉素NZ2114基因在畢赤酵母中表達(dá)

將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含20 ml BMGY（含Zeocin 500 μg/ml）培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 ml菌液轉(zhuǎn)移至200 ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加1%的含量100%甲醇，共培養(yǎng)120 h。

1.2.3 菌絲霉素NZ2114組成型表達(dá)菌株的中試發(fā)酵

一級種子：上述篩選得到的抗菌活性最強(qiáng)的重組菌株斜面菌種，用接菌針將其接入含YPD培養(yǎng)基100 ml的500 ml錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)17 h；二級種子：按10%的接種量接入含有YPD培養(yǎng)基9 L的20 L發(fā)酵罐，同樣條件下培養(yǎng)約24 h。

50 L罐發(fā)酵：培養(yǎng)在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基為25 L的YPD培養(yǎng)基，接種前校正pH值電極和溶氧電極，培養(yǎng)過程中保持通氣量大于60 L/min，發(fā)酵過程中菌體利用葡萄糖產(chǎn)酸，用氨水溶液調(diào)節(jié)pH值5.0，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30.0℃，起始轉(zhuǎn)速為250 r/min，隨著菌體的生長不斷提高轉(zhuǎn)速，發(fā)酵過程中控制溶氧大于20%，培養(yǎng)96 h后放罐。每24 h取少量發(fā)酵液，測定其菌體濕重、葡萄糖殘?zhí)橇?、蛋白含量、抑菌活性以及MIC值。轉(zhuǎn)速、溫度、pH值和溶氧等參數(shù)由發(fā)酵罐自動檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 菌絲霉素NZ2114組成型表達(dá)菌株的中試發(fā)酵產(chǎn)物測定

發(fā)酵液蛋白濃度測定：取100 μl的發(fā)酵液溶液于小試管中，用雙蒸水調(diào)整體積到1 ml，然后加入5 ml考馬斯亮藍(lán)試劑，充分振蕩混合，5 min后于595 nm測定光吸收值。以1 ml雙蒸水及加5 ml考馬斯亮藍(lán)試劑作為空白對照。

發(fā)酵液抑菌活性測定：以金黃色葡萄球菌CMCC26003為實(shí)驗(yàn)菌株，將金黃色葡萄球菌懸浮液（OD600nm=0.5～0.6）50 μl與 46 ℃的 LB 固體培養(yǎng)基100 ml混勻后鋪平板，待其凝固后4℃保存，用無菌打孔器打孔，每孔中滴加待測培養(yǎng)發(fā)酵液上清（誘導(dǎo)0、24、48、72、96 h）5 μl，待孔中液體被培養(yǎng)基吸收完全后，上述平板37℃倒置培養(yǎng)過夜（10～12 h）。以同體積的無菌水培養(yǎng)上清為陰性對照，氨芐青霉素（Amp）為陽性對照。

發(fā)酵液MIC測定：將受試菌CMCC26003在平板劃線，再轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，至對數(shù)生長期，用生理鹽水調(diào)節(jié)受試菌液，使之在OD625nm=0.09～0.1，然后按1∶100稀釋，搖勻。發(fā)酵液菌絲霉素蛋白用微孔濾膜過濾，加入受試菌中，并使終濃度稀釋為1 200、1 500、2 000倍。然后置于37℃條件下，培養(yǎng)12 h?？瞻讓φ諡槲醇影l(fā)酵液和氨芐青霉素。陽性對照為氨芐青霉素（100 μg/ml）。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建與鑒定

以pUC57為模板，利用上下游特異性引物F和R，通過PCR方法獲得編碼菌絲霉素NZ2114蛋白的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在500 bps附近得到目的條帶，與預(yù)期大小相符（見圖2）。PCR擴(kuò)增得到的基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶（Xho I和AvrII）雙酶切后將NZ2114基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα上，位于α因子信號肽突變體序列的下游，得到重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114，Zeocin抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子并送生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定。挑取抗性平板上的多拷貝轉(zhuǎn)化子，30℃、220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果（見圖2）顯示：NZ2114基因位于α-factor突變體基因下游，二者總共約500 bps，PCR鑒定所得到編碼重組蛋白菌絲霉素NZ2114的DNA序列與預(yù)期一致，即所挑取重組子呈陽性轉(zhuǎn)化子。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 菌絲霉素NZ2114基因在畢赤酵母中表達(dá)

將上述PCR鑒定呈陽性的重組轉(zhuǎn)化子接種于含20 ml BMGY（含Zeocin 500 μg/ml）培養(yǎng)基中的試管中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 ml菌液轉(zhuǎn)移至200 ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加1%的含量100%甲醇，共培養(yǎng)120 h后，離心收集發(fā)酵液上清。發(fā)酵液上清的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明，重組轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶（見圖3），與菌絲霉素NZ2114蛋白的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定甲醇誘導(dǎo)重組轉(zhuǎn)化子的抗菌活性結(jié)果也顯示（見圖4），重組轉(zhuǎn)化子甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。

圖3 甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素的發(fā)酵液電泳分析

圖4 誘導(dǎo)畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素的發(fā)酵液抑菌活性

2.3 菌絲霉素NZ2114組成型表達(dá)菌株的中試發(fā)酵

經(jīng)電泳系統(tǒng)篩選得到工程菌畢赤酵母pPicZα-NZ2114，通過種子活化和二級種子擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)入50 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵研究。如圖5所示，工程菌畢赤酵母pPicZα-NZ2114接種后0～4 h，菌體濕重緩慢增加，處于適應(yīng)期，4 h后，菌體開始快速生長進(jìn)入指數(shù)生長期，利用葡萄糖產(chǎn)酸導(dǎo)致pH值下降，緩慢流加氨水維持pH值在5.0左右。至發(fā)酵24 h后，加入甲醇誘導(dǎo)，隨著發(fā)酵誘導(dǎo)時間的延長，抗菌活性增強(qiáng)，甲醇誘導(dǎo)48 h后，菌絲霉素NZ2114在畢赤酵母表達(dá)開始進(jìn)入平臺期，抗菌活性增長緩慢，至甲醇誘導(dǎo)96 h，抗菌活性達(dá)到最大，停止發(fā)酵，取發(fā)酵液離心保存上清。結(jié)果顯示：培養(yǎng)0～24 h階段，細(xì)胞濕重達(dá)到151.23 g/l，菌體細(xì)胞數(shù)最大值達(dá)到37億個/ml，8 h后的殘?zhí)橇烤S持0.05%；甲醇誘導(dǎo)0～96 h階段，發(fā)酵液菌體濕重保持不變，菌體細(xì)胞數(shù)略有下降，蛋白濃度達(dá)到606 μg/ml。

圖5 50 L發(fā)酵罐種子在不同時間段的生長情況

2.4 菌絲霉素NZ2114組成型表達(dá)菌株中試發(fā)酵產(chǎn)物的檢測

取發(fā)酵液離心的上清，經(jīng)XCell SureLock?Mini-Cell蛋白垂直電泳系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶（見圖6），與菌絲霉素NZ2114蛋白的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定甲醇誘導(dǎo)菌絲霉素NZ2114蛋白的抗菌活性結(jié)果也顯示（見圖7），重組轉(zhuǎn)化子甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。

圖6 不同時間段畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素的Tricine-SDS-PAGE分析

圖7 誘導(dǎo)畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素的發(fā)酵液抑菌活性

50 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)96 h獲取發(fā)酵液上清，將上清用微孔濾膜過濾，加入受試菌中，并使終濃度稀釋為1 200、1 500、2 000倍。然后置于37℃條件下，培養(yǎng)12 h。空白對照為未加發(fā)酵液和氨芐青霉素。陽性對照為氨芐青霉素(100 μg/ml)。結(jié)果顯示：氨芐青霉素對金黃色葡萄球菌CMCC26003的MIC為0.028 6 μg/ml，菌絲霉素發(fā)酵液誘導(dǎo)96 h對金黃色葡萄球菌CMCC26003的MIC等效于氨芐青霉素0.012 3～0.016 3 μg/ml。

圖8 誘導(dǎo)96 h時畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素發(fā)酵液的MIC

3 討論

目前，全球抗生素濫用情況日益嚴(yán)重，導(dǎo)致越來越多傳統(tǒng)抗生素耐藥致病菌株的產(chǎn)生，使人們重新審視抗生素的定位和作用。越來越多的國家對抗生素在農(nóng)產(chǎn)品中的添加予以限制和禁止，因此，迫切需要開發(fā)能夠取代傳統(tǒng)抗生素的新型添加劑[5]。防御素具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理、不易產(chǎn)生耐藥性和殺菌高效性的優(yōu)勢，并且具有多靶向性和多作用途徑的免疫保護(hù)促進(jìn)作用，有望成為新一代的抗感染藥物，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。

體外實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道[6]，菌絲霉素對G-和真菌抑菌效果不理想，而對G+的幾個種類（包括鏈球菌屬、葡萄狀球菌屬、腸球菌屬、棒狀桿菌屬和桿狀菌屬）具有殺傷作用，尤其是菌絲霉素對肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）的MIC僅為0.125 mg/l[2]，與萬古霉素和青霉素的殺菌速率相當(dāng)[7]。菌絲霉素具有良好的鹽離子耐受能力，在生理鹽離子濃度下同樣具有殺菌活性。此外，它還具有良好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在pH值2.0～10.0范圍內(nèi)，菌絲霉素對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性；100℃熱處理1 h后，亦能抵抗木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的降解[8]。此外，菌絲霉素對鼠類L929成纖維細(xì)胞、正常的人角質(zhì)化表皮細(xì)胞（NHEK）、肺成纖維細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞都沒有細(xì)胞毒性，對人血紅細(xì)胞、兔血紅細(xì)胞也沒有溶血性[6]。

研究開發(fā)防御素的主要任務(wù)是尋求低成本且獲得大量高活性抗菌肽的工藝。天然提取的防御素非常有限，化學(xué)合成成本高，且其分子中含有3～4對二硫鍵，化學(xué)合成也比較困難，不足以滿足臨床需要。通過基因工程表達(dá)技術(shù)以其低成本、重組肽活性高和可以對基因進(jìn)行改造等優(yōu)勢，在防御素表達(dá)中得到迅速發(fā)展和應(yīng)用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)，已有多種外源蛋白在酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并得以應(yīng)用。它具有完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、蛋白質(zhì)加工修飾及分泌能力，而且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素[9]。此方法獲得的菌絲霉素方便快捷，不會因內(nèi)毒素而導(dǎo)致動物機(jī)體中毒和腹瀉；同時，組成型區(qū)別于甲醇誘導(dǎo)型的酵母表達(dá)方式，培養(yǎng)簡單，無需更換碳源，也可以避免揮發(fā)性的毒性物質(zhì)甲醇污染動物機(jī)體和環(huán)境[5]。

4 結(jié)語

本研究基于菌絲霉素具有良好的穩(wěn)定性，通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)菌絲霉素NZ2114基因，通過信號肽將其分泌到細(xì)胞外，并進(jìn)行了50 L發(fā)酵罐的中試研究。結(jié)果顯示：菌體濕重后期增長緩慢，其主要原因是菌絲霉素NZ2114在表達(dá)的過程中，隨著菌絲霉素NZ2114蛋白濃度不斷上升，其表現(xiàn)出對酵母宿主菌的毒性作用，當(dāng)表達(dá)的菌絲霉素NZ2114蛋白濃度達(dá)到一定濃度后，宿主菌停止生長，菌絲霉素NZ2114表達(dá)進(jìn)入平臺期后結(jié)束發(fā)酵；菌絲霉素NZ2114發(fā)酵液稀釋1 500～2 000倍對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有抑制作用；該發(fā)酵周期短，培養(yǎng)簡單方便，成本低。后期主要提高菌絲霉素NZ2114基因工程菌的生物量及其表達(dá)量，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，為日后的規(guī)?；笊a(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；同時促進(jìn)抗菌肽菌絲霉素在獸藥、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物抗病基因工程方面等領(lǐng)域上的發(fā)展。