■ 王 勇 張錦玲 張立明 郭 鵬 袁麗佳 劉大程

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

酵母菌在特殊的發(fā)酵工藝下能夠產(chǎn)生多種營養(yǎng)活性物質(zhì)，如葡聚糖、甘露聚糖、氨基酸、多肽、有機酸等，這些營養(yǎng)活性物質(zhì)在調(diào)控瘤胃功能和提高反芻動物免疫功能方面發(fā)揮積極的功效[1-2]。但前期科研工作中也發(fā)現(xiàn)，復合酵母菌培養(yǎng)物在固態(tài)發(fā)酵過程存在著缺陷：培養(yǎng)物中活性物質(zhì)的產(chǎn)生規(guī)律及含量不清楚；發(fā)酵工藝多依靠技術(shù)工人的經(jīng)驗來控制，缺乏科學數(shù)據(jù)的支持；發(fā)酵結(jié)束后復合菌培養(yǎng)物質(zhì)量的均一性較差，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。

現(xiàn)階段，對固態(tài)發(fā)酵動力學模型的研究大多在實驗室條件下進行，且以β-葡聚糖、甘露聚糖為產(chǎn)物建立動力學模型研究鮮見報道，菌體生長動力學模型建立時，多以測定菌體細胞組分含量為主，如葡萄糖胺[3]、核酸[4]和麥角固醇[5]，但這些方法通常較復雜，且發(fā)酵基質(zhì)成分對結(jié)果也可能會產(chǎn)生干擾[6]。M.R.Terebiznik等[6-8]通過測定發(fā)酵過程中發(fā)酵料干重的變化成功建立了估算發(fā)酵不同階段菌體生物量的數(shù)學模型。

綜上所述，本研究建立的動力學模型以生產(chǎn)實際為基礎(chǔ)，通過測定發(fā)酵基質(zhì)干重的變化估算菌體生物量，建立菌體生成動力學模型，以β-葡聚糖、甘露聚糖為活性產(chǎn)物建立產(chǎn)物生成動力學模型，應用這些模型對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，對發(fā)酵過程進行預測及控制，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠色飼料添加劑提供有力的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究分別于2014年9月、10月和11月在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市某生物科技有限公司發(fā)酵車間進行。

1.1 材料與儀器

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，SC）BC株、XR4株，均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院反芻動物微生態(tài)制劑項目組菌種庫；酵母菌活化培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[9]：培養(yǎng)基的基質(zhì)成分及配比為麩皮52.69%、玉米片20.45%、玉米粉16.07%、米糠 4.09%、棉粕1.86%、豆粕 3.99%和無機鹽 0.85%；β-葡聚糖、甘露聚糖、鉛化玻璃珠(粒徑0.45～0.6 mm，英國Sigma-Aldrich公司)。

安捷倫LC1100液相色譜儀（原產(chǎn)地美國）、T6系列紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、Thermo Scientific生物安全柜（原產(chǎn)地德國）、HPS-160恒溫生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）、Sigma 2-16pk高速低溫冷凍離心機（SIGMA公司）、Sartorius精密電子分析天平（德國賽多利斯公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗方法

試驗菌種制備：取 4℃ 保存的BC、XR4斜面菌種3環(huán)，接種于含有300 ml無菌麥芽汁培養(yǎng)基的1.5 L三角瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后接種于50 L液體發(fā)酵罐中，30℃、180 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48 h。

固態(tài)發(fā)酵：發(fā)酵料水質(zhì)量比為1∶0.52，充分攪拌后，將混合好的發(fā)酵料堆放于發(fā)酵池（2 m×1.5 m×1.5 m）內(nèi)，料高55 cm。

1.3 分析方法

1.3.1 采樣

用采樣器每隔3 h從固態(tài)發(fā)酵料表層下15～20 cm處均勻取樣100 g，緯線圈法[10]取樣225 g，混合均勻后，平均分為9份，3份樣品用于測定干重，3份樣品用于測定葡聚糖和甘露聚糖，剩下3份在80℃條件下烘干至恒重，用于測定底物總糖。

1.3.2 底物干重測定

稱取不同時間的樣品16 g，80℃烘干至恒重，稱重[7]。

1.3.3 葡聚糖和甘露聚糖含量的測定

酵母破壁：渦流微珠破壁法[11]。

收集多糖：處理后的樣品用冷卻的去離子水充分清洗，收集玻璃珠，并收集洗液，重復5次。沉淀物加入3 ml去離子水，充分振蕩，收集洗液，重復5次，合并洗液。將所得液體55℃靜置24 h蒸發(fā)水分[12]。

酸水解：72%(w/w)的硫酸溶液進行酸水解[13]。

單糖含量測定:采用液相色譜-示差折光檢測器測定樣品及校正多糖中甘露糖和無水葡萄糖含量[14]。

結(jié)果計算:以校正多糖的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標制備校正曲線，得出回歸方程。樣品的峰面積代入回歸方程中計算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。

1.3.4 底物總糖測定

采用硫酸蒽酮法測定底物總糖[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長動力學模型的建立

2.1.1 底物干重變化與菌體生物量關(guān)系的確定在固態(tài)發(fā)酵過程中，將底物烘干后，底物組成為[8]：

式中：W——發(fā)酵料干重(g)；

S——固態(tài)基質(zhì)干重(g)；

B——菌體生物量（g）；

P——產(chǎn)物質(zhì)量（g）；

dW/dt——發(fā)酵料干重變化率（g/h）；

dS/dt——固態(tài)基質(zhì)消耗速率（g/h）；

dB/dt——菌體生長速率（g/h）；

dP/dt——產(chǎn)物生成速率（g/h）。

在固態(tài)發(fā)酵過程中，底物的消耗主要由于菌體生長、維持菌體生長和生成產(chǎn)物造成[15]，因此，可將式（2）變換為：

其中：

式中：(dS/dt)g——菌體生長消耗固態(tài)基質(zhì)速率(g/h)；

(dS/dt)m——菌體維持消耗固態(tài)基質(zhì)速率（g/h）；

(dS/dt)p——產(chǎn)物生成消耗固態(tài)基質(zhì)速率（g/h）；

Yg——菌體生物量相關(guān)系數(shù)；

Yp——產(chǎn)物生成相關(guān)系數(shù)；

-km——維持菌體相關(guān)系數(shù)。

通過式（1）～（6）可得出底物干重與菌體生物量的關(guān)系：

其中：

式中：γ、δ、k1和k2均為方程常數(shù)。

由Borzani等研究[8]可知，固態(tài)發(fā)酵過程中底物干重變化主要可分為2個階段，結(jié)合圖1、圖2中底物干重變化可知，0～21 h為第1階段，21～30 h為第2階段，方程分別為：

式中：W1——第1階段發(fā)酵料干重（g）；

W2——第2階段發(fā)酵料干重（g）；

W0——發(fā)酵料起始干重（g）；

B0——初始菌體生物量（g）；

μ——菌體生長比生長率（h-1）；

t——發(fā)酵時間（h）；

ta——第1階段結(jié)束時間（h）；

tb——第2階段結(jié)束時間（h）；

kt——方程常數(shù)。

由式（7）～（11）可得底物干重的變化與菌體生物量的關(guān)系式：

式中：Bs——不同時間菌體生物量（g）。

將底物干重結(jié)果帶入式（10）和式（11）中，利用Origin 8軟件進行曲線擬合，不同階段擬合曲線見圖1和圖2，擬合方程式：

方程（13）和（14）的R2分別為0.974 9和0.929 9,方程均極顯著（P＜0.000 1），表明方程計算所得干重值可以分別解釋第1階段97.49%的干重變化和第2階段92.99%的干重變化，曲線擬合度較好。

由式（10）、（12）、（13）和（15）可得第1階段菌體生物量的表達式：

由式（11）、（12）、（14）和（16）可得第2階段菌體生物量的表達式：

圖1 第1階段干重變化擬合曲線

圖2 第2階段干重變化擬合曲線

2.1.2 Logistic模型的建立

Logistic模型是一個典型的S型曲線，通常被看作是一個表現(xiàn)細胞生長與營養(yǎng)物質(zhì)之間的非線性關(guān)系的經(jīng)驗方程，能很好地反映該過程中菌體濃度增加對自身生長的抑制作用[16]，因此，采用此模型描述復合酵母生長動力學特性，Logistic方程[17]：

式中：Bm——最大菌體生物量（mg/g）；

μm——菌體生長最大比生長率（h-1）。

通過方程（17）和（18）計算所得生物量數(shù)據(jù)利用Origin 8軟件進行擬合，參數(shù)估計值見表1。

表1 Logistic方程參數(shù)估計值

則復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵菌體生長動力學模型為：

方程(21)的R2為0.959 8，方程極顯著（P＜0.001），表明方程曲線擬合度較好，可以描述復合酵母菌在發(fā)酵過程中的生長情況。

2.2 產(chǎn)物生成動力學模型的建立

本研究用Luedeking-Piret方程來描述β-葡聚糖、甘露聚糖和菌體生長的關(guān)系[18]，即：

α、β為動力學參數(shù)，當α=0，β≠0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為非偶聯(lián)型；α≠0，β≠0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為部分偶聯(lián)型；α≠0，β=0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為偶聯(lián)型。本研究中，β-葡聚糖和甘露聚糖為酵母細胞壁的主要成分，其中β-葡聚糖為酵母細胞壁的主要多糖[19-21]，由于以β-葡聚糖和甘露聚糖建立Luedeking-Piret方程研究較少，因此，對模型的建立進行分類討論。

①假設(shè)β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為偶聯(lián)型，即當β=0時，式（22）可簡化為：

當t=0時，P=P0，將方程(19)帶入方程(23)中，可得：

將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P、B，以及P0、B0帶入式（25）中，在軟件1stOpt15PRO中利用Levenberg-Marquardt法和通用全局優(yōu)化法求回歸系數(shù)，可得：α1=4.09，α2=1.27。

②假設(shè)β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為部分偶聯(lián)型，即β≠0，

當t=0時，P=P0，將方程(19)帶入方程(22)中，可得：

積分可得：

式中：P0——起始產(chǎn)物質(zhì)量（g）。

將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P、B以及P0、B0帶入式（27）中，在軟件1stOpt15PRO中利用Levenberg-Marquardt法和通用全局優(yōu)化法求回歸系數(shù)，可得：α1=5.083 5，β1=-3.23×10-5；α2=2.38，β2=-2.17×10-4。

由于β1和β2的值近似為0，因此，可知兩種產(chǎn)物的生成與菌體的生長為偶聯(lián)型，則可得：

β-葡聚糖生成模型：

甘露聚糖生成模型：

方程（28）和（29）R2分別為0.913 0和0.906 5，方程均極顯著（P＜0.000 1），表明所選方程可以較好的反映產(chǎn)物生成的實際情況，相關(guān)性結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 β-葡聚糖生成與菌體生物量相關(guān)性

圖4 甘露聚糖生成與菌體生物量相關(guān)性

2.3 底物消耗動力學模型的建立

常用的底物消耗動力學模型是基于底物消耗物料恒算建立的Luedeking-Piret/like方程式[22]，即：

式中：St——底物總糖含量（mg/g）；

St0——起始底物總糖含量（mg/g）；

YBt——總糖用于菌體生長的得率常數(shù)；

k——維持常數(shù)。

酵母發(fā)酵過程中，總糖的消耗與產(chǎn)物合成僅有間接關(guān)系，假設(shè)基質(zhì)的消耗用于產(chǎn)物合成的比例很小，可忽略不計，認為總糖的消耗僅用于菌體的生長，所以式（30）可簡化為：

將式（19）帶入式（31）積分得：

將不同時間點的B、St和B0帶入式（32）中，在軟件1stOpt15PRO中利用Levenberg-Marquardt法和通用全局優(yōu)化法求回歸系數(shù)，可得：YBt=0.112，S0=128.12。

則可得底物消耗動力學模型為：

方程（33）R2為0.949 6，方程均極顯著（P＜0.000 1），表明所選方程可以很好的反映底物消耗的實際情況，相關(guān)性分析見圖5。

圖5 底物總糖消耗與菌體生物量相關(guān)性

2.4 模型準確性分析

為了驗證模型的準確性，在相同條件下進行復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵的重復實驗3次，實驗結(jié)果取平均值，與動力學模型計算值進行比較，結(jié)果見表2。

表2 復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵菌體生物量、甘露聚糖含量、β-葡聚糖含量和底物總糖含量動力學模型理論值與實際值對比

由表2可知，發(fā)酵料干重、甘露聚糖含量、β-葡聚糖含量和底物總糖含量的相對誤差基本都小于10%，說明建立的動力學模型能較好地描述生產(chǎn)實際中復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵過程。

3 結(jié)論

①以固態(tài)發(fā)酵料干重變化為基礎(chǔ)建立了復合酵母菌菌體生物量生長Logistic動力學模型，B=方程極顯著（P＜0.001），通過模型驗證，干重模型平均相對誤差為0.94%，間接表明在生產(chǎn)實際中復合酵母菌的生長符合Logistic方程。

②通過對Luedeking-Piret方程參數(shù)α和β分類討論并計算，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖與甘露聚糖的生成與酵母菌為偶聯(lián)型，其中β-葡聚糖生成模型P=80.79+4.09甘露聚糖生成模型P=R2分 別 為0.913 0和0.906 5，平均相對誤差分別為4.71%和3.7%，方程均極顯著（P＜0.000 1）。底物消耗動力學模 型R2為0.949 6，平均相對誤差為6.63%，方程極顯著（P＜0.000 1），說明模型可較好地描述發(fā)酵過程，對優(yōu)化實際生產(chǎn)工藝，控制和預測發(fā)酵過程具有重要的參考價值。