徐慧君，譚細鳳

（武警浙江總隊嘉興醫(yī)院，浙江嘉興314000）

·實驗研究·

桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷Hela細胞及其機制研究

徐慧君，譚細鳳

（武警浙江總隊嘉興醫(yī)院，浙江嘉興314000）

目的探討桔梗皂苷D是否能增強多柔比星對宮頸癌細胞的殺傷活性及機制。方法MTT法檢測多柔比星單獨治療及聯(lián)合桔梗皂苷D治療對宮頸癌細胞系Hela的殺傷活性。用熒光定量PCR方法檢測人正常宮頸上皮細胞系CRL-2614及宮頸癌細胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表達水平。將Hela細胞用桔梗皂苷D和多柔比星處理后，用熒光定量PCR方法檢測Hela細胞PKM2的表達水平。將Hela細胞用桔梗皂苷D和多柔比星處理后，檢測Hela細胞葡萄糖的攝取能力和乳酸生成能力。構建PKM2真核表達載體，MTT法檢測PKM2表達載體轉染對桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細胞活力抑制率的影響。結果對照組，1μmol/L桔梗皂苷D組，5μmol/L桔梗皂苷D組，10μmol/L桔梗皂苷D組，0.1 mg/L多柔比星組，0.5 mg/L多柔比星組，1 mg/L多柔比星組對Hela細胞活力的抑制率分別為0、（4.5±0.4）%、（21.2±1.8）%、（55.4±4.2）%、（7.0±1.1）%、（27.6±2.1）%、（60.8± 5.2）%，不同濃度桔梗皂苷D組間及多柔比星組間對Hela細胞的抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1μmol/L桔梗皂苷D對Hela細胞的抑制率為（4.1±0.4）%，0.1 mg/L多柔比星對Hela細胞的抑制率為（7.2±0.6）%，兩者聯(lián)合對Hela細胞的抑制率達到 （59.5±3.9）%。正常宮頸上皮細胞系CRL-2614及宮頸癌細胞系Hela、SiHa、C-33a的PKM2相對表達量為別為1.00±0.03、17.5±0.6、12.4±0.4、13.8±0.5，三種宮頸癌細胞系的PKM2表達量與CRL-2614細胞系相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組相比，桔梗皂苷D組的PKM2相對表達水平，葡萄糖相對攝取量及乳酸相對生成量均顯著下降，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉染PKM2表達載體后，桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細胞的抑制率從 （60.1±4.2）%下降到 （22.4±2.1）%，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論桔梗皂苷D通過下調PKM2的表達抑制腫瘤細胞的糖代謝，協(xié)同多柔比星殺傷宮頸癌Hela細胞系。

宮頸癌；桔梗皂苷D；丙酮酸激酶M2；糖代謝；Hela；多柔比星

宮頸癌是全球發(fā)病率第二位的婦科腫瘤，每年有超過50萬患者被診斷為宮頸癌，化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1]。多柔比星是一種抗腫瘤藥物，通過抑制腫瘤細胞DNA/RNA的生物合成起到殺傷腫瘤細胞的目的，但腫瘤細胞的藥物抵抗往往制約著多柔比星的臨床應用[2]。因此，尋找其他的藥物與多柔比星進行聯(lián)合用藥以增強多柔比星的抗腫瘤活性是目前腫瘤治療研究的重點。本研究從2013年1月~2015年5月完成于本院實驗室，研究的目的在于探討桔梗皂苷D是否能增強多柔比星對宮頸癌細胞的殺傷活性，并研究其具體機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞系Hela、SiHa、C-33a及人正常宮頸上皮細胞系CRL-2614購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。所有細胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并將細胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。細胞每2~3天傳代一次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.1.2試劑 多柔比星， 噻唑藍 [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium

bromide，MTT]購于美國Sigma-Aldrich公司，桔梗皂苷D購于美國Sigma-Aldrich公司（SMB00424）。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。Trizol試劑，逆轉錄試劑盒，pcDNA3.1，Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。葡萄糖檢測試劑盒 （Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase assay kit）購于美國Molecular Probes公司，乳酸檢測試劑盒（Lactate assay kit）購于美國BioVision公司。SYBR Green試劑購于日本TaKaRa。PKM2和GAPDH（內參）PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下:PKM2上游:5’-GCCTGGCGCCCATTACCA-3’，下游:5’-CCCACTGCAGCACTTGAAG-3’;GAPDH上游:5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′，GAPDH下游:5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。

1.2方法

1.2.1熒光定量PCR檢測PKM2的表達 分別檢測Hela、SiHa、C-33a以及CRL-2614中PKM2的表達水平，所有細胞的總RNA用Trizol試劑提取，之后用逆轉錄試劑盒按照說明書步驟進行cDNA的合成。以該cDNA為模板，在PCR體系中加入PKM2或GAPDH的引物，再加入SYBR Green試劑，按照SYBR Green操作說明書步驟進行PKM2基因的定量PCR實驗，PKM2的相對表達由2-△△CT法計算[3]。

1.2.2Hela細胞葡萄糖的攝取及乳酸的檢測 用葡萄糖檢測試劑盒檢測DMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C0表示。將Hela細胞按1×104/孔接種在96孔板上，加入200μL DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入桔梗皂苷D及多柔比星處理2小時 （對照組不加藥物處理2小時），按照試劑盒說明書步驟檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C表示，則各組葡萄糖絕對攝取量△C=C0-C。葡萄糖的相對攝取量可用以下公式計算：葡萄糖相對攝取量=（△C對照組-△C治療組）/△C對照組。乳酸的相對生成量檢測步驟及計算方法與葡萄糖相同。

1.2.3質粒構建及轉染 將PKM2基因的開放閱讀框架全序列（Gene ID:NM_001206796）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成pcDNA3.1-PKM2重組真核表達質粒[4]，質粒的轉染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟進行，將pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）轉染入Hela細胞中，培養(yǎng)24小時。

1.2.4MTT法檢測藥物對腫瘤細胞殺傷活性 將Hela細胞按 5×103/孔接種在 96孔板上。將pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）轉染入Hela細胞中，孵育24小時。然后再分別加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L桔梗皂苷 D及 0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L多柔比星培養(yǎng)48小時。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清，在570nmol/L波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。為了研究桔梗皂苷D對多柔比星的協(xié)同抗腫瘤作用，作者根據兩者單獨治療對Hela細胞的殺傷活性來選擇桔梗皂苷D及多柔比星的聯(lián)合治療濃度。選擇桔梗皂苷D或多柔比星單獨治療僅輕微殺傷Hela細胞時的濃度作為兩者聯(lián)合的濃度。

1.3統(tǒng)計學處理 所有實驗重復3次，實驗數據用（）表示，并用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，采用非配對雙邊t檢驗進行分析。

2 結果

2.1桔梗皂苷D與多柔比星對Hela細胞的抑制作用 桔梗皂苷D及多柔比星單獨治療對Hela的殺傷活性如表1所示。由于1μmol/L桔梗皂苷D或0.1 mg/L多柔比星僅輕微殺傷Hela細胞，因此選擇這兩個濃度的桔梗皂苷D或多柔比星進行聯(lián)合治療，探討兩者的協(xié)同效應。實驗結果發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星可協(xié)同殺傷Hela細胞，見表2。

表1 桔梗皂苷D與多柔比星對Hela細胞的抑制作用（）

與對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與1μmol/L桔梗皂苷

組別 n/孔 細胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.1 1μmol/L桔梗皂苷D組 3 4.5±0.4▲5μmol/L桔梗皂苷D組 3 21.2±1.8**10μmol/L桔梗皂苷D組 3 55.4±4.2##**0.1 mg/L多柔比星組 3 7.0±1.1▲▲0.5 mg/L多柔比星組 3 27.6±2.1□□1 mg/L多柔比星組 3 60.8±5.2△△□□

表2 桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細胞的抑制作用（）

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與桔梗皂苷D組比較##P<0.01；與多柔比星組比較△△P<0.01

組別 n/孔 細胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.1桔梗皂苷D組 3 4.1±0.4*多柔比星組 3 7.2±0.6**聯(lián)合治療組 3 59.5±3.9##△△**

2.2宮頸癌細胞系PKM2的表達 三種宮頸癌細胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表達水平均顯著高于人正常宮頸上皮細胞系CRL-2614，詳見表3。

表3 宮頸癌細胞系上調PKM2的表達（）

與CRL-2614細胞比較*P<0.05

細胞系 n/孔 相對表達量CRL-2614 3 1.00±0.03 Hela 3 17.5±0.6*SiHa 3 12.4±0.4*C-33a 3 13.8±0.5*

2.3桔梗皂苷D顯著下調Hela細胞PKM2的表達水平并抑制其糖代謝 選擇1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星進行聯(lián)合治療，探討兩者聯(lián)合對Hela細胞的協(xié)同效應。如表4所示，桔梗皂苷D能顯著下調Hela細胞PKM2的表達水平并抑制其葡萄糖的攝取和乳酸的生成，而多柔比星則對PKM2表達水平及糖代謝無影響。

表4 桔梗皂苷D及多柔比星對Hela細胞PKM2表達及糖代謝的影響（）

與對照組比較**P<0.01；與桔梗皂苷D組比較##P<0.01；與多柔比星組比較△△P<0.01

組別 n/孔 PKM2相對表達水平 葡萄糖相對攝取量 乳酸相對生成量對照組 3 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.06桔梗皂苷D組 3 0.39±0.03**0.67±0.06**0.60±0.06**多柔比星組 3 1.01±0.07 1.02±0.06 0.97±0.05聯(lián)合治療組 3 0.40±0.04##△△0.65±0.06##△△0.61±0.05##△△

2.4過表達PKM2顯著抑制桔梗皂苷D對多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應 選擇1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星進行聯(lián)合治療，如表5所示，體外轉染PKM2表達載體顯著抑制桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細胞的協(xié)同殺傷效應。

表5 PKM2表達載體顯著抑制桔梗皂苷D對多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應（）

與對照組比較**P<0.01；與聯(lián)合治療組比較##P<0.01

組別 n/孔 細胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.01聯(lián)合治療組 3 60.1±4.2**聯(lián)合治療+ pcDNA3.1-PKM2組 3 22.4±2.1##

3 討論

桔梗皂苷D是桔梗總皂苷的主要活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調節(jié)的作用，近期的文獻報道，桔梗皂苷D還具有顯著的抗肝癌和肺癌的生物活性，能誘導肝癌和肺癌細胞凋亡和周期阻滯[5-7]。在本研究中，作者同樣發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D在較高濃度時（10μmol/L）有較好的抗宮頸癌活性，Hela細胞活力抑制率為（55.4±4.2）%，而更為重要的是，桔梗皂苷D在較低濃度時（1μmol/L）能聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷Hela細胞，提高化療藥物多柔比星對宮頸癌細胞的治療效果，1μmol/L桔梗皂苷D對Hela細胞的抑制率為 （4.1±0.4）%，0.1mg/L多柔比星對Hela細胞的抑制率為 （7.2±0.6）%，兩者聯(lián)合后對

Hela細胞的抑制率達到（59.5±3.9）%。

腫瘤細胞的一個重要特征是與正常細胞相比，它們的糖代謝異常旺盛。腫瘤細胞能攝取更多的葡萄糖，但大部分葡萄糖卻不進入氧化磷酸化釋放能量，反而進行有氧糖酵解合成更多的中間產物，最后生成乳酸，而這些中間產物往往是合成核酸和蛋白質的原料[8]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是有氧糖酵解過程中的關鍵酶，腫瘤細胞PKM2往往異常高表達以促進有氧糖酵解的進行[9-10]。有文獻報道腫瘤細胞的化療藥物耐藥和腫瘤細胞的糖代謝異常有關[11-12]，因此作者進一步研究桔梗皂苷D對多柔比星的協(xié)同效應是否和腫瘤細胞的糖代謝有關。

首先作者通過實驗發(fā)現(xiàn)三種宮頸癌細胞系（Hela，SiHa和C-33a）的PKM2表達水平均高于正常宮頸上皮細胞系CRL-2614 10倍以上，表明腫瘤的發(fā)生可能和PKM2的異常表達有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷 D能顯著降低 Hela細胞的PKM2表達水平并減弱Hela細胞對葡萄糖的攝取和乳酸的生成，表明桔梗皂苷D能顯著抑制宮頸癌細胞的糖代謝和有氧糖酵解。為了證實桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對宮頸癌細胞的協(xié)同殺傷效應依賴于PKM2的下調，作者構建了PKM2重組表達質粒，使PKM2在Hela細胞中過表達。作者發(fā)現(xiàn)當Hela細胞中的PKM2發(fā)生過表達后，桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對 Hela細胞的抑制率從 （60.1± 4.2）%下降到（22.4±2.1）%。所有這些結果都證實了桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷宮頸癌細胞的機制是靶向于PKM2基因。

綜上所述，桔梗皂苷D具有化療藥物增效的作用，其分子機制可能為通過下調PKM2的表達抑制腫瘤細胞的糖代謝以增強化療藥物對宮頸癌細胞的殺傷活性。這些實驗結果為桔梗皂苷D與化療藥物的聯(lián)合治療方案提供了理論依據。

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