孫麗平， 丁利忠， 王雪姣， 陳思

益氣固本膠囊對(duì)哮喘小鼠組織病理改變及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、P-Smad3水平的作用

孫麗平， 丁利忠， 王雪姣， 陳思

目的 觀察不同劑量益氣固本膠囊對(duì)哮喘小鼠病理及氣道重塑中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響。方法 將60只雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組和益氣固本膠囊低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組均以卵清白蛋白致敏和激發(fā)復(fù)制哮喘模型，于第21天起，在每次激發(fā)前1 h分別給予模型組和用藥各組以純凈水及藥物灌胃，正常組不給予任何處置。應(yīng)用HE染色觀察各組小鼠氣道及肺組織的病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織TGF-β1和P-Smad3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 小鼠氣道病理切片觀察模型組的氣管、肺組織病理改變程度高于正常組、地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地塞米松干預(yù)組與益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常組相比，TGF-β1蛋白在模型組、地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組表達(dá)水平增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；地塞米松干預(yù)組與益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣固本膠囊高劑量組與益氣固本膠囊低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常組相比，P-Smad3蛋白在模型組、地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組表達(dá)水平增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組P-Smad3蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；地塞米松干預(yù)組P-Smad3蛋白表達(dá)比童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；童康片組與益氣固本膠囊高劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣固本膠囊高劑量組與益氣固本膠囊低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 益氣固本膠囊可抑制哮喘小鼠體內(nèi)TGF-β1和P-Smad3的過度表達(dá)，從而阻斷TGF-β1胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可在一定程度上減輕哮喘小鼠氣道炎癥和抑制氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。

哮喘； 益氣固本膠囊/治療應(yīng)用； 氣道重塑； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； Smad3； 小鼠

氣道重塑作為支氣管哮喘的重要病理變化之一，與哮喘的嚴(yán)重程度及癥狀存在密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信號(hào)通路是哮喘氣道重塑形成的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一，包括配體、受體或受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)環(huán)節(jié)[1]，TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的促氣道纖維化因子，也是研究哮喘氣道重塑的重點(diǎn)[2]，其通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積和基底膜層成纖維細(xì)胞增生[3-4]，Smads蛋白是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，在TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Smad3蛋白起正性調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)其生物學(xué)表達(dá)活性，促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生發(fā)展[5]。益氣固本膠囊系根據(jù)國(guó)家名老中醫(yī)王烈教授驗(yàn)方制成，用于哮喘病緩解期的治療，具有益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)肺脾腎的功效，本方臨床運(yùn)用多年，可有效降低哮喘復(fù)發(fā)率[6]。但其在氣道重塑中是否發(fā)揮作用尚未可知。本課題選擇P-Smad3作為TGF-β1/Smad通路的下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，觀察不同劑量益氣固本膠囊對(duì)哮喘小鼠氣道重塑中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響，研究其抑制氣道重塑作用，以期進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量19～21 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001)。

1.2 儀器與藥物 CC2170A型超聲霧化器(成都維信電子科大新技術(shù)有限公司)；TGF-β1成套免疫組織化學(xué)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；P-Smad3抗體(bs-3425R北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；卵清白蛋白(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；測(cè)平均吸光度值為日本尼康NIS-ELEMENTs BR軟件；地塞米松(阿特維斯佛山制藥有限公司)，童康片(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)，益氣固本膠囊(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠哮喘模型制作與分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠分為正常組、模型組、地塞米松干預(yù)組、童康片組、益氣固本膠囊高劑量組和益氣固本膠囊低劑量組，每組10只。除正常組外，其余組均于第0、7、14天經(jīng)腹腔注射含卵清白蛋白20 mg、氫氧化鋁200 mg的致敏液，按20 mL/kg進(jìn)行注射，正常組不給予任何處置。第21天起，除正常組外，其余組以5%卵清白蛋白溶液霧化激發(fā)，每次30 min，連續(xù)10 d，在每次激發(fā)前1 h按20 mL/kg分別給予各組以純凈水及藥物灌胃，正常組不給予任何處置。根據(jù)臨床用量，折算成小鼠的等效劑量如下：地塞米松0.412 5 mg/kg；童康片0.42 g/kg；益氣固本膠囊高劑量組2.2 g/kg；益氣固本膠囊低劑量組1.1 g/kg。

1.3.2 肺組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠于末次激發(fā)后1～2 h處死，取0.5 cm氣管及部分肺組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，用于組織病理學(xué)觀察。觀察方法:觀察每張切片至少5個(gè)具有代表性的高倍視野，根據(jù)每個(gè)視野中氣道上皮細(xì)胞的脫落及肺組織炎癥細(xì)胞所占的比例得出其炎癥程度，每個(gè)視野中氣道脫落的上皮細(xì)胞及肺組織炎癥細(xì)胞所占比例之和<15%屬正常范圍，為0級(jí)；16%～30%屬輕度，為1級(jí)；31%～60%屬中度，為2級(jí)；>60%屬重度，為3級(jí)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 檢測(cè)步驟按說明書進(jìn)行，依次為切片常規(guī)脫臘至水，3%過氧化氫阻斷10 min，煮沸20 min抗原修復(fù)，兔血清封閉20 min，一抗37 ℃孵育1 h，生物素化二抗孵育20 min，滴加鏈霉素化親和素試劑20 min，DAB鏡下控制染色，HE復(fù)染2 min，酒精脫水二甲苯透明，中性膠封固，顯微鏡下觀察氣道及肺組織著色情況。陽性結(jié)果呈棕黃色，每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)高倍鏡下支氣管視野(×400)，應(yīng)用NIS-ELEMENTs BR分析軟件測(cè)定陽性部位的平均吸光度(mean optical density，MOD)，MOD值越大，蛋白表達(dá)水平越高，10個(gè)MOD值的均值即為該片的MOD值。

2 結(jié)果

2.1 氣管、肺組織病理學(xué)切片觀察及分級(jí)結(jié)果 見表1。高倍鏡下觀察氣道、肺組織病理改變情況可見：正常組支氣管結(jié)構(gòu)未見異常改變，支氣管黏膜上皮完整，肺泡結(jié)構(gòu)未見異常改變，炎癥浸潤(rùn)<15%，為正常范圍，屬0級(jí)；模型組肺組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下可見水腫，氣道上皮細(xì)胞可見脫落，支氣管壁明顯增厚；用藥各組病理改變較模型組減輕(圖1，見封三)。

表1結(jié)果表明，6組小鼠肺組織病理改變程度分級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，正常組與模型組、用藥各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與用藥各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；地塞米松干預(yù)組與童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；童康片組與益氣固本膠囊高、低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣固本膠囊高、低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺組織TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白的表達(dá) 見表2。TGF-β1蛋白表達(dá)于胞漿(圖2，見封三)，P-Smad3蛋白表達(dá)于胞漿和胞核(圖3，見封三),呈棕黃色表達(dá)。

表2結(jié)果表明，6組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，與正常組相比，TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白在模型組和用藥各組表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，用藥各組TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；地塞米松干預(yù)組TGF-β1蛋白與益氣固本膠囊高、低劑量組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地塞米松干預(yù)組TGF-β1蛋白表達(dá)低于童康片組，(P<0.01)。地塞米松干預(yù)組P-Smad3蛋白比童康片組、益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 童康片組P-Smad3蛋白與益氣固本膠囊高、低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣固本膠囊高、低劑量組TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表達(dá)相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

哮喘氣道重塑的主要結(jié)構(gòu)變化包括：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液腺下腺體增生、杯狀細(xì)胞增生、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積、氣道平滑肌增厚等，其中平滑肌細(xì)胞增生肥大占有重要地位[7]。TGF-β1可刺激平滑肌細(xì)胞數(shù)目增多，體積增大，促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，加速氣道重塑的形成[8-10]。Smads蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成員，為TGF-β受體復(fù)合物的下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，TGF-β1與其Ⅰ、Ⅱ受體結(jié)合后被激活，與受體調(diào)節(jié)型蛋白結(jié)合(Smad2、3)，并使之活化，繼而與Smad4形成雜聚體，轉(zhuǎn)移入核后，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌和凋亡，而Smad7可阻滯TGF-β1受體Ⅰ[11]。由此可見，在TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，Smad3發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，從而促進(jìn)氣道重塑的發(fā)展，而Smad7發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制TGF-β1的表達(dá)，從而抑制氣道重塑的發(fā)展。Caraci等[12]發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)表達(dá)和膠原蛋白的產(chǎn)生，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。Shin等[13]發(fā)現(xiàn)經(jīng)卵清白蛋白激發(fā)哮喘的小鼠，與正常對(duì)照組相比，TGF-β1、P-Smad3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，孟魯司特可降低TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)水平，減輕哮喘氣道炎癥與肺纖維化。

西醫(yī)學(xué)對(duì)哮喘的治療方案有吸入糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動(dòng)劑，口服白三烯受體拮抗劑氨茶堿，抗IgE單克隆抗體治療，抗生素治療，變應(yīng)原特異性免疫療法，抗腫瘤壞死因子α治療等，地塞米松是治療哮喘的抗炎藥物。

本研究所用益氣固本膠囊系根據(jù)王烈教授驗(yàn)方制成，其主要成分為黃芪、玉竹、五味子、補(bǔ)骨脂、女貞子、太子參等，用于哮喘病緩解期的治療，具有益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)肺脾腎的功效。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾、腎經(jīng)，入肺充肺氣，入脾健脾胃以絕生痰之源，入腎補(bǔ)腎臟之元?dú)獠蛔?；補(bǔ)骨脂、女貞子為臣藥，補(bǔ)腎中之陰陽；牡蠣、五味子收斂肺氣、固表止汗為佐藥；達(dá)到補(bǔ)肺助其宣降以清痰窠，健脾助其運(yùn)化以絕痰源，補(bǔ)腎壯其元?dú)庖猿浞胃?，從而除伏痰，鏟夙根，臨床運(yùn)用多年，有降低哮喘復(fù)發(fā)率的作用。前期研究已表明，該藥可以通過調(diào)節(jié)肺氣虛、脾氣虛和腎陽虛小鼠免疫功能而發(fā)揮治療哮喘作用[14-17]。

本研究旨在研究益氣固本膠囊是否有可能通過抑制氣道重塑而發(fā)揮治療哮喘的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了不同劑量益氣固本膠囊對(duì)哮喘小鼠氣道重塑中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的調(diào)控，為其臨床應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

對(duì)照藥童康片為臨床常用調(diào)節(jié)免疫力的中成藥，其成分為黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、山藥、牡蠣、陳皮，具有補(bǔ)肺固表，健脾益胃，扶助人體正氣的功效，臨床常作為哮喘患兒的輔助治療藥物。

分析本研究的氣管、肺組織病理學(xué)切片：與模型組相比，用藥各組氣道上皮脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等程度較輕，氣道炎癥改善。且地塞米松干預(yù)組與益氣固本膠囊高劑量組、益氣固本膠囊低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，益氣固本膠囊高劑量組與益氣固本膠囊低劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明益氣固本膠囊改善氣道炎癥的效果與地塞米松相似，且與劑量無明顯關(guān)系。

分析本研究的免疫組織化學(xué)結(jié)果：與正常組相比，TGF-β1蛋白在模型組和用藥各組表達(dá)顯著增強(qiáng)；與模型組相比，用藥各組TGF-β1蛋白表達(dá)降低；地塞米松干預(yù)組與益氣固本膠囊高、低劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)相當(dāng)；益氣固本膠囊高、低劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)相當(dāng)；表明益氣固本膠囊抑制TGF-β1蛋白過度表達(dá)的效果與地塞米松相似，且與劑量無明顯關(guān)系。與正常組相比，P-Smad3蛋白在模型組和用藥各量組表達(dá)水平增強(qiáng)；與模型組相比，用藥各組P-Smad3蛋白表達(dá)降低；地塞米松干預(yù)組比童康片組、益氣固本膠囊高、低劑量組P-Smad3蛋白表達(dá)更低；童康片組與益氣固本膠囊高劑量組P-Smad3蛋白表達(dá)相當(dāng)；益氣固本膠囊高、低劑量組P-Smad3蛋白表達(dá)相當(dāng)，表明益氣固本膠囊有抑制P-Smad3蛋白過度表達(dá)的作用，但效果不如地塞米松明顯，且與劑量無明顯關(guān)系。

以上結(jié)果顯示，益氣固本膠囊可能是通過下調(diào)肺組織TGF-β1、P-Smad3的蛋白表達(dá)，影響TGF-β1/Smad信號(hào)通路，從而減輕氣道炎癥，延緩氣道重塑，進(jìn)一步研究可為其治療哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯：劉穎)

Effects of Yiqi Guben capsules on pathological changes and the levels of transforming growth factor beta 1 and P-Smad3 in asthmatic mice

SUNLiping,DINGLizhong，WANGXuejiao,CHENSi.

PediatricDepartmentinAffiliatedHospitalofChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，130021Changchun,China.

Objective To observe the effects of different doses of Yiqi Guben capsules on pathology and TGF-β1/Smad signaling pathway in airway remodeling of asthmatic mice.Method The 60 male SPF level BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group, dexamethasone intervention(DSMS) group, Tongkang(TKP) group, Yiqi Guben capsules high dose(YQGBH) group and Yiqi Guben capsules low dose(YQGBL) group, with 10 mice in each group. Apart from the normal group, the other groups were sensitized and stimulated by ovalbumin to copy asthma model. On and from the 21stday, each group was given gavage with pure water and medicines 1 h prior to each excitation except the normal group.Observe pathological changes of airway and lung tissues in each group with HE staining, and detect expression of TGF-β1and P-Smad3 protein in lung tissues with immunohistochemistry.Result The trachea and lung tissue pathological change degree in model group was statistically higher than that of normal group, model group, DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group according to airway pathological examination(P<0.05)；comparing DSMS group with YQGBH group and YQGBL group，the difference was not statistically significant(P>0.05).Compared with normal group，TGF-β1protein expression levels in model group, DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group statistically increased(P<0.01)； compared with model group, TGF-β1protein expression levels statistically decreased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01)； comparing DSMS group with YQGBH group and YQGBL group，there was no statistical significance(P>0.05)；comparing YQGBH group with YQGBL group，the difference was not statistically significant(P>0.05)；compared with normal group, the expression levels of P-Smad3 protein increased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01)；compared with model group, the P-Smad3 protein expression levels decreased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group with statiscal significance(P<0.01)；the P-Smad3 protein expression level of DSMS group was even lower than TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01) and the difference was of statistical significance；comaring TKP group with YQGBH group, the difference was not statistically significant(P>0.05)；comparing YQGBH group with YQGBL group, there was no statistically significant difference(P>0.05). Conclusion Yiqi Guben capsules can block TGF-β1intracellular signal transduction by inhibiting excessive expression of TGF-β1and P-Smad3 in asthma mice, which to a certain extent, reduces asthma airway inflammation in mice and inhibits the occurrence of airway remodeling.

asthma; Yiqi Guben capsules/therapeutic use; airway remodeling; TGF-β1; Smad3; mouse

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473729)；2012年度吉林省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(2012Z125)；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101209JC)

130021 長(zhǎng)春，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(孫麗平，丁利忠，陳思)；130117 長(zhǎng)春，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(王雪姣)

孫麗平(1970-)，女，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。研究方向:中醫(yī)藥防治小兒肺系疾病的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：slpwzt7063@163.com。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.006

R-33

A

1674-3865(2015)04-0311-05

2015-04-20)