汪麗菁 呂航 程向東

外源性microRNA跨物種應(yīng)用研究進(jìn)展

汪麗菁 呂航 程向東

microRNAs（miRNAs）［1］是在生物體中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別目的mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解目的mRNA或者阻遏目的mRNA翻譯，進(jìn)而影響相應(yīng)蛋白表達(dá)，最終實現(xiàn)對生物體生理機(jī)能的調(diào)控作用，如已有證據(jù)表明，在多種腫瘤樣本的致瘤部位，某些抑癌基因的miRNA顯著上調(diào)，而癌基因的miRNA含量則顯著低于正常［2］。

1 外源性miRNA跨物種研究概述

原先認(rèn)為，miRNA是內(nèi)源性調(diào)控作用。但是近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的調(diào)控功能，不僅局限于生物體內(nèi)，而且在寄生物與宿主之間也廣泛存在［3］。Stern-Ginossar 等［4］發(fā)現(xiàn)，人巨細(xì)胞病毒編碼的miRNA—hcmv-miR-UL112在病毒感染過程中特異地下調(diào)了主要組織相容性復(fù)合物I相關(guān)B鏈（MICB）的表達(dá)，減少其與NK細(xì)胞激活受體（NKG2D）的結(jié)合，并降低NK細(xì)胞的殺傷能力，從而導(dǎo)致宿主致病。Weiberg A等［5］發(fā)現(xiàn)灰霉菌能通過分泌小RNA進(jìn)入植物內(nèi)部，從而抑制植物的免疫功能；大腸桿菌的小RNA-OxyS和DsrA通過調(diào)控che-2和F42G9.6基因表達(dá)分別引起線蟲化學(xué)感覺行為受損和壽命縮短［6］。人們開始意識到，寄生物能夠通過miRNA影響宿主生命周期，導(dǎo)致宿主致病。同時，宿主也可以通過miRNA反向調(diào)控寄生物的生命周期。人MiR-122通過影響cyclin G1/p53通路對HBV病毒復(fù)制起調(diào)控作用［7］，但同時miR-122也會與HCV mRNA 5’非編碼區(qū)相互作用引起HCV病毒增殖［8］。感染水皰性口炎病毒（VSV）的小鼠通過表達(dá)miR-24和miR-93錨定VSV的L蛋白和P蛋白基因，抑制VSV增殖［9］；鐮刀細(xì)胞病患者的紅細(xì)胞通過表達(dá)miR-451和let-7i，靶向作用惡性瘧原蟲的mRNA，抑制其生長［10］。最新的研究表明，外源性miRNA的影響，不僅局限于宿主與寄生物之間，而且可以通過攝入外源性miRNA對機(jī)體產(chǎn)生影響。Zhang等［11］于2012年首次報道在人體血液中檢測出大米MiR-168a，并調(diào)控人低密度脂蛋白受體銜接蛋白1基因（LDLRAP1）。Zhou等［12］還發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定存在于中藥金銀花湯劑中的金銀花miRNA，可以通過小鼠灌胃方式進(jìn)入小鼠循環(huán)系統(tǒng)，并有效抑制小鼠體內(nèi)的流感病毒A。同時，如其他來源的乳制品中，現(xiàn)也發(fā)現(xiàn)部分miRNA不會因為工業(yè)加工過程而降解，并且依然可以被人體攝入和吸收，最終可在人體血液中被檢測出其存在［13］。以往這些研究發(fā)現(xiàn)，不僅打破了外源性miRNA會被機(jī)體核酸酶降解而失去調(diào)控能力的結(jié)論，并且給外源性miRNA的應(yīng)用提供更廣闊的臨床研究價值。尤其是攝入性獲取外源性miRNA的研究驗證，對中國傳統(tǒng)中藥藥理的作用機(jī)制研究具有十分深遠(yuǎn)的影響，同時為癌癥等多基因疾病的治療，提供了一個新的、具有發(fā)展?jié)摿Φ闹委熓侄魏头椒ā?/p>

2 外源性miRNA應(yīng)用

miRNA可作用于胞質(zhì)［14］，且具有穩(wěn)定性高［15，16］、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，這更易作用于靶基因。且與shRNA和siRNA相比，外源性miRNA是最有可能實現(xiàn)不同物種之間的多基因調(diào)控［17］。但如何將外源miRNA有效轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，通過細(xì)胞膜，并釋放作用于靶基因仍然是一個科學(xué)難題。由于病毒載體的安全性問題，目前開發(fā)的RNA治療方案多采用siRNA導(dǎo)入細(xì)胞胞質(zhì)，沉默目的基因。而miRNA因為調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的作用，逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)已可通過人工合成miRNA的方式干預(yù)mRNA的表達(dá)［18］。目前開展的以外源miRNA作為治療的技術(shù)基礎(chǔ)，基本與siRNA類似，即通過脂質(zhì)體或大分子載體方式，將miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞胞質(zhì)。但在此基礎(chǔ)上已經(jīng)有了新的技術(shù)進(jìn)展。

2.1 脂質(zhì)納米轉(zhuǎn)運(yùn)載體 陽離子脂質(zhì)體作為核酸的載體已經(jīng)在生物學(xué)實驗中應(yīng)用超過20多年。DOTMA是首次用于核酸輸送載體的陽離子脂質(zhì)之一［19］。后來發(fā)展了一類稱為類脂的分子（lipidoids）。因其結(jié)構(gòu)成分類似細(xì)胞膜，容易被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，而＜100nm的納米脂質(zhì)體不會被肺毛細(xì)血管濾過性截留，能順利進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)目的組織細(xì)胞［20］。人工合成的MiR-34a［21］，即臨床藥物MRX34（臨床I期（NCT01829971）就是通過可電離化的直徑在120nm左右的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)［22］，用于治療肝癌和肝癌轉(zhuǎn)移。并且采用類似的方法轉(zhuǎn)運(yùn)miR-34a能提高非小細(xì)胞肺癌患者對埃羅替尼的敏感性［23］。由于胞內(nèi)的miRNA通常采取外泌體（exosomes）［24］、脫落囊泡（SVs）［25］等微囊經(jīng)微囊泡（MVs）的主動分泌方式運(yùn)轉(zhuǎn)miRNA至胞外。并且發(fā)現(xiàn)MVs其表面蛋白分子能夠作為靶細(xì)胞膜表面配體而靶向輸送至受體細(xì)胞［26］。而且miRNA裝載進(jìn)入外泌體是一個受RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）的特殊蛋白控制的選擇性過程［27］。并且MVs能夠夠保護(hù)miRNA不被RNA酶降解［28］。Alvarez等［29］證實采用內(nèi)源性外泌體作為靶向細(xì)胞載體的可能性，并成功治療鼠阿爾茨海默病。Ohno S等［30］研究證實外泌體在體內(nèi)可將抗腫瘤的miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至乳腺癌細(xì)胞，認(rèn)為采用內(nèi)源性MVs可作為藥物傳送系統(tǒng)的載體。在其他的研究中也發(fā)現(xiàn)，通過內(nèi)源性MVs，被FITC標(biāo)記的外源性MiR-150能夠下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1中的Myb基因，促進(jìn)遷移的發(fā)生［31］。并且當(dāng)?shù)鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（brefeldin A）抑制血小板微粒釋放后，原本能夠正常轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞的熒光標(biāo)記的miRNA和外源性線蟲miRNA，被完全抑制。表明外源性miRNA是通過微囊運(yùn)輸?shù)竭_(dá)靶細(xì)胞并發(fā)生作用的［25］。Zhu等［32］將靶向唾液酸粘附素和CD163受體的miRNA轉(zhuǎn)入外泌體，并作用于豬肺泡巨噬細(xì)胞，有效抑制豬感染繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）。因此，采用內(nèi)源性囊泡作為載體運(yùn)輸外源miRNA，能夠更加有效地到達(dá)靶細(xì)胞，發(fā)揮作用。將會是新的脂質(zhì)體研究方向。

2.2 大分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體 在脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)中，膽固醇的加入促進(jìn)了核酸進(jìn)入細(xì)胞，并且保護(hù)核酸不被核酸酶降解，同時膽固醇還能靶向運(yùn)輸至腎臟和肝臟［33］，使人們認(rèn)識到這類蛋白作為核酸靶向運(yùn)輸載體的可能性；另一個發(fā)現(xiàn)能夠穩(wěn)定miRNA結(jié)構(gòu)的蛋白是Ago2，它使miRNA在循環(huán)系統(tǒng)中的存留時間延長，并能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至目的細(xì)胞［34，35］。這些非囊泡來源的大分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，豐富了外源性miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。一些諸如適配子（Aptamer）和細(xì)胞穿透肽（CPPs）形式的轉(zhuǎn)運(yùn)載體被應(yīng)用到小RNA轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)上。（1）適配子：得益于近年來，配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）的發(fā)展，適配子（Aptamer）能被廣泛用于生物體內(nèi)靶向特定細(xì)胞的特異性寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體［36］。具有高親和力、特異性強(qiáng)結(jié)合寡核苷酸的Aptamer雖需經(jīng)過多輪SELEX技術(shù)篩選，但其易合成修飾，低免疫原性和穩(wěn)定性的“化學(xué)抗體”特點(diǎn)，使其能被應(yīng)用于疾病的治療和診斷［37］。目前已經(jīng)篩選出許多小干擾RNA（siRNA）-aptamer能夠進(jìn)入靶定細(xì)胞，沉默目的基因，并且在體內(nèi)和體外實驗中已經(jīng)獲得證實［38～42］。miRNA-aptamer的研究［43］相對于siRNA-aptamer起步較晚，目前研究較多的有特異性結(jié)合與受體酪氨酸激酶致癌基因-Axl的GL21.T適配子，它能特異性結(jié)合合成的let-7g miRNA序列，抑制腫瘤［44］。（2）細(xì)胞穿透肽：人們自從20 世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的某些蛋白質(zhì)后，開始對此類蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性研究。并通過對HIV-1病毒的Tat 蛋白以及果蠅的觸角足同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白的片段研究，發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基數(shù)為10～16的多肽片段具有上述跨膜功能，并將這類肽稱之為細(xì)胞穿透肽（CPPs）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTDs）。Bolhassani［45］在其綜述中給出了已發(fā)現(xiàn)的主要CPPs的序列，雖然目前發(fā)現(xiàn)的CPPs數(shù)目不斷增長，但對其細(xì)胞穿透功能研究仍主要集中在Tat肽以及觸角足肽（penetratin）上。利用CPPs傳遞小RNA 的研究進(jìn)展也多局限于Tat肽、MPG肽和多聚精氨酸肽。Zhang Y等［46］采用精氨酸多肽（R8）特異性結(jié)合反義MiR-21形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)至膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，使細(xì)胞遷移率下降25%。Cheng CJ等［47］采用pH誘導(dǎo)的跨膜多肽（pHIP）成功轉(zhuǎn)運(yùn)反義miR-155治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）。進(jìn)一步證實了miR-155/DLBCL小鼠模型中采用這個治療方法比當(dāng)前臨床采用的方法毒性更小。

3 展望

內(nèi)源性miRNA由于其穩(wěn)定性和特異性，已經(jīng)越來越成為疾病診斷和預(yù)測的重要生物標(biāo)志物，而外源性miRNA由于其能夠跨物種的作用形式，也越來越被人們所重視。并且由于miRNA低毒高效、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，一方面可用于多基因病（如癌癥等）的治療，不僅可以聯(lián)合化療藥物，提高化療藥物敏感性，而且可能成為新的臨床用藥；另一方面由于新近發(fā)現(xiàn)植物miRNA能夠通過胃腸道進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，不僅可以作為完善長期食用藥食植物對機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)的作用依據(jù)，也必將成為中藥活性成分的新開發(fā)方向。然而，雖然外源性miRNA具有能夠跨物種作用于機(jī)體的優(yōu)勢，但仍面臨著諸多難題。雖然miRNA相對于siRNA作用更加長效，但如何保證所需外源性miRNA攝入后不被機(jī)體核酸酶降解，并有效轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞，以及還未有長期使用的毒性學(xué)實驗驗證，都制約了外源性miRNA的開發(fā)。但可以預(yù)見，隨著新的低毒性載體的研制，miRNA仍將成為核酸生物醫(yī)學(xué)的新治療手段。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃課題（2010KYA042）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院超聲科（汪麗菁）

31006 浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（呂航 程向東）

*通訊作者