陳甫寰宋慧鋒王統(tǒng)民何秀葉綜述，岳曉彤審校

（解放軍醫(yī)學院解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科北京100048）

·綜述·

汗腺細胞在人體皮膚創(chuàng)傷及修復中的研究進展

陳甫寰宋慧鋒王統(tǒng)民何秀葉綜述，岳曉彤審校

（解放軍醫(yī)學院解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科北京100048）

汗腺作為人體最大的器官-皮膚重要的附屬器，在人體中具有重要的作用。大面積重度燒創(chuàng)傷患者因其皮膚均為增生性瘢痕修復，大部分汗腺結構被破壞且無法再生，失去了通過汗液蒸發(fā)來調控體溫這一基本功能，嚴重影響了患者的生存質量。組織工程技術的發(fā)展為大面積皮膚缺損修復提供了新的方法，并獲得了一定療效。文章首先借助于前言文獻研究，介紹汗腺細胞的基本形態(tài)，功能等；其次，探究相關干細胞向汗腺細胞的分化進展研究，詳細地介紹了表皮干細胞、間充質干細胞及毛囊干細胞向汗腺細胞的分化，以及其分化的通路MAPK，ERK等介紹；然后對汗腺細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀進行了闡述；最后研究分析了再生汗腺細胞用于皮膚創(chuàng)傷與修復。

汗腺；汗腺細胞；表皮干細胞；間充質干細胞；皮膚創(chuàng)傷；修復

汗腺作為皮膚的重要附屬器官，在物質代謝、調節(jié)體溫以及維持體液平衡等方面都具有重要作用。對于人體而言，當外界環(huán)境溫度高于30℃時，傳導、對流以及輻射等散熱方式停止作用，通過汗腺細胞分泌汗液成為人體唯一的散熱途徑［5］。汗腺分為外泌汗腺和頂漿汗腺，即俗稱的大汗腺和小汗腺。外泌汗腺可達數百萬個，分布于人體除嘴唇、外耳道、陰蒂和陰唇的全身各處，以手掌和腳底處的皮膚最多［6-8］。有關實驗研究發(fā)現(xiàn)，新生的汗腺細胞（Sweat Gland Cel ls，SGCs）在形態(tài)上多呈現(xiàn)圓形、錐體形、橢圓形或短柱狀，當細胞生長密集時則多呈扁平的不規(guī)則多角形，并且中間會出現(xiàn)圓形核。各組織塊長出的汗腺細胞匯合時，可觀察到“鋪路石”般的外觀，局部可以觀察到“穹窿”或“拉網”狀等汗腺細胞生長的特征現(xiàn)象。而隨著生長周期的延長，傳代汗腺細胞在貼壁時呈現(xiàn)圓形，然后細胞逐步伸展，并且透明度增高，細胞形態(tài)也以橢圓形或短柱狀為主［9］。

嚴重燒創(chuàng)傷患者殘余的汗腺導管或者分泌部的細胞是皮膚創(chuàng)面自然愈合的修復細胞之一，這種作用也已經達到一種共識。在汗腺中分離出來的多能或者單能干細胞可以促進皮膚創(chuàng)面愈合，其作用主要還是形成汗腺［10］；在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面，汗腺分泌部的單層上皮細胞可以逆分化為表皮干細胞［11］；為比網狀層深處的創(chuàng)口提供修復細胞（毛囊隆突部已經受損）。這個過程很緩慢，正因為這一點導致肉芽組織和瘢痕的形成。

1　汗腺細胞的體外培養(yǎng)研究

有關細胞和組織的傳統(tǒng)研究方法主要采用二維培養(yǎng)模式獲得細胞［12］，但是二維培養(yǎng)的細胞難以很好地模擬體內細胞微環(huán)境，也難以保持在體細胞的分化功能，而三維培養(yǎng)模式則能夠彌補這些不足。近年來，隨著細胞外基質的發(fā)展，使得進行體外三維重建外泌汗腺結構成為可能［13］。Shenyou等［14］使用經Ⅱ型膠原酶消化分離的人體外泌汗腺組織，進行體外三維培養(yǎng)，并對構建的三維組織進行了形態(tài)學分析。實驗結果顯示，通過倒置相差顯微鏡觀察經Ⅱ型膠原酶消化后的大量汗腺組織游離，其在貼壁后3～5d長出汗腺細胞，細胞持續(xù)分裂達2～3周，并形成圍繞汗腺組織塊的環(huán)狀單層，3～4周后出現(xiàn)細胞衰老。再將汗腺細胞接種于Mat rigel基底膜基質中，2～3周后細胞開始分裂，然后相繼形成小細胞團、管狀以及類球狀結構；混合培養(yǎng)物在約2周時開始液化，培養(yǎng)隨之終止。HE染色顯示部分細胞形成中空管狀結構，管壁由1～2層細胞組成，這種管狀結構類似于體內汗腺的分泌部和導管部。通過免疫組織化學染色可見，所培養(yǎng)的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性。結果表明，經三維培養(yǎng)的人體外泌汗腺細胞，接種于Mat rigel基底膜基質所形成的組織結構模擬了在體汗腺的組織形態(tài)結構。

Tan Zhi jun等［15］研究了汗腺細胞的分離、培養(yǎng)、純化和表型鑒定。首先將取自人體腹部皮膚的組織樣本采用Ⅱ型膠原酶消化處理，實驗過程中通過倒置相差顯微鏡觀察可見培養(yǎng)皿中有大量游離的汗腺腺體組織，被從組織樣本中分離出來。分離得到的汗腺腺體組織經一段時間的培養(yǎng)后，可以觀察到新生的汗腺細胞從汗腺腺體中間呈輻射狀，向腺體周圍生長，并且呈現(xiàn)出不規(guī)則的多角形和扁平狀的形態(tài)特征。在新生的汗腺細胞外圍有少量呈長梭形的成纖維細胞，對此在實驗中使用胰酶-EDTA消化處理后，結果顯示可以將汗腺細胞周圍95%以上的成纖維細胞去除。最后對純化的汗腺細胞經免疫細胞化學染色，結果顯示成纖維細胞特異性蛋白和細胞波形蛋白均為陰性，而汗腺細胞標志物CEA、CK8則為陽性，證明所培養(yǎng)的細胞為汗腺細胞，成纖維細胞則在胰酶-EDTA消化處理中被有效去除。

2　干細胞向汗腺細胞分化的研究

隨著組織工程皮膚的發(fā)展，對于汗腺再生的研究越來越受廣大學者的關注。如：利用胚胎干細胞和誘導多功能干細胞進行汗腺再生；李海紅等［16］證實的利用骨髓間質充質干細胞進行汗腺再生，劉愛軍等［17］用ESP源性表皮干細胞修復小鼠創(chuàng)傷皮膚的實驗，Suaudcan［18］證實了iPS細胞代替ESP進行汗腺再生的可能。筆者將介紹眾多原始細胞中的表皮干細胞和臍帶間充質干細胞向汗腺細胞的分化。2.1表皮干細胞向汗腺細胞分化

表皮干細胞（Epidermal Stem Cel ls，ESCs）作為皮膚組織的特異性干細胞，是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復及改建的關鍵性細胞［19］。因此，可通過誘導表皮干細胞定向分化汗腺細胞，這是汗腺再生的重要途徑之一。

根據研究，首先通過降低β1整合素的表達和MAPK活性，從而使得表皮干細胞退出干細胞群落，進而參與汗腺的發(fā)生與汗腺細胞的定向分化。然后控制ECM改建酶-基質金屬蛋白酶（MMPs），調節(jié)ECM、MMPs與生長因子的相互作用［20-21］，通過誘導表皮干細胞分泌LN、FN來影響其合成與分泌MMP-2與MMP-7，從而影響汗腺原基細胞的出現(xiàn)，在通過MMPs對ECM的作用，定向引導了汗腺原基細胞向汗腺胚芽細胞并突破基底膜區(qū)向真皮區(qū)切入，從而向成熟的汗腺細胞分化；并且宋志芳等［22］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以誘導人表皮干細胞向汗腺細胞的一個分化，可能一直通過p63來完成之一轉化。

2.2間充質干細胞向汗腺細胞分化

間充質干細胞（mesenchyme stem cel ls，MSCs）以其具有組織再生和功能重建的巨大潛能激勵著研究者們不斷探索MSCs的應用價值。周崗等［18］研究了人骨髓間充質干細胞向汗腺細胞誘導培養(yǎng)中的基因表達方式，通過分離純化并體外擴增MSCs，對參照組和不同誘導組進行觀測細胞形態(tài)學變化，以及采用RT-PCR、流式細胞儀等方法檢測融合細胞基因和蛋白的表達特征。實驗結果顯示，在不同條件培養(yǎng)液中人骨髓間充質干細胞的誘導培養(yǎng)均能存活，并且當培養(yǎng)達到一定時間后，其細胞形態(tài)會由間充質干細胞的長梭狀開始向SGCs的扁平狀轉變。隨著培養(yǎng)時間的進一步延長，與汗腺發(fā)生形成密切的基因EGF和EGFR出現(xiàn)高度表達。實驗結果展示了在不同介質誘導培養(yǎng)下，人骨髓間充質干細胞可以在形態(tài)學和分子水平上，表現(xiàn)出向SGCs橫向分化的潛能。蔡颯等［23］通過人體外分別分離培養(yǎng)MSCs和SGCs，再經原代培養(yǎng)SGCs融合。實驗結果也展示出在沒有完整汗腺細胞存在的情況下，人骨髓間充質干細胞在體外可以誘導分化為人汗腺細胞。

Ai Li等［24］通過體外分別分離培養(yǎng)、擴增，并鑒定骨髓間充質干細胞和汗腺細胞，建立汗腺細胞體外熱休克模型。通過對比骨髓間充質干細胞形態(tài)學變化，以及應用免疫組織化學和流式細胞儀法檢測對比，結果顯示骨髓間充質干細胞能夠被成功誘導向汗腺細胞轉化，獲得汗腺細胞表型。建立適當的體外汗腺誘導培養(yǎng)體系，中胚層骨髓間充質干細胞通過跨胚層分化途徑能夠轉變?yōu)楹瓜偌毎?。郝文杰?5］研究了人臍帶間充質干細胞向汗腺細胞的轉化，并分析了表皮細胞生長因子對轉化的影響，以及細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路在轉化過程中的作用。采用組織塊法培養(yǎng)獲得了純化的臍帶間充質干細胞，通過膠原酶消化法獲得了純化的汗腺細胞。實驗顯示臍帶間充質干細胞與熱損傷的SGCs經Transwel l板間接共同培養(yǎng)后，部分臍帶間充質干細胞表面抗原CK7、CK19、CEA表達陽性，說明臍帶間充質干細胞已經具有SGCs的表型，顯示體外SGCs損傷的微環(huán)境具有促進臍帶間充質干細胞向SGCs分化的作用。研究中還發(fā)現(xiàn)EGF能夠明顯促進臍帶間充質干細胞向汗腺細胞轉化。并且在采用共培養(yǎng)的方法誘導臍帶間充質干細胞向SGCs轉化，以及在EGF促進臍帶間充質干細胞向汗腺細胞轉化的過程中，ERK通路具有重要作用。

2.3毛囊干細胞向汗腺細胞分化

在王瑤［26］的研究中，分別采用“酶消化-毛囊剝離-酶消化”和“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”兩種方法，進行體外分離毛囊干細胞（Hai r Fol l icle Stem Cel ls，HFSCs），實驗顯示HFSCs在適宜的微環(huán)境中，可以被誘導分化為SGCs。通過建立的共培養(yǎng)誘導體系將HFSCs定向誘導分化得到SGCs。并且試驗還顯示誘導分化而來的汗腺細胞是有功能的，能夠參與皮膚創(chuàng)面中的汗腺再生。

3　汗腺細胞的臨床應用研究

近年來，隨著皮膚組織工程的不斷發(fā)展，汗腺再生的研究廣泛應用于皮膚創(chuàng)傷和修復手術當中，這為提高大面積燒傷患者存活后的生活質量帶來了希望。如通過干細胞移植誘導汗腺再生，并驗證再生的汗腺具有發(fā)汗功能，對實現(xiàn)創(chuàng)傷的修復給出了希望。

盛志勇院士等［27］通過成體干細胞誘導出汗腺細胞，并成功將汗腺細胞分別種植于裸鼠損傷汗腺皮膚及成人瘢痕皮膚處，實驗結果表明：裸鼠治療側腳掌足墊處可見大片汗腺腺體組織，有發(fā)達且盤曲的分泌部；免疫組化檢測證實汗腺組織結構完整，包含完整的分泌部和導管部；CK14在其所在處皮膚基底層和汗腺導管部連續(xù)分布，CEA染色顯示有完整發(fā)達的汗腺組織，創(chuàng)面汗腺結構也就可見CK8和BrdU雙染色性細胞；相對裸鼠而言，人體試驗結果顯示2例患者的治療區(qū)發(fā)汗試驗均陽性，治療區(qū)創(chuàng)面愈合部位真皮淺層有大量CEA陽性細胞，并且較為集中，形態(tài)和汗腺組織極為相似。裸鼠及成人的對照組均未有上述實驗組表現(xiàn)。雖然人體試驗的病例數相對而言較少，且種植面積的局限性，但為人們進一步尋找外分泌汗腺再生修復途徑提供了新的思路及方法。

目前，對原發(fā)性手汗癥（Pr imary Palmar Hyperhidrosis，PPH）發(fā)病機制的研究尚無明確結論，現(xiàn)有研究多認為PPH發(fā)病機制與交感神經的過度興奮有關，因此，相關研究多關注對交感神經本身及其相關神經遞質等的研究［28］。但基于汗液的主要成分分析，其成分主要經由汗腺細胞膜上相關蛋白轉運而實現(xiàn)汗液的分泌過程，水通道蛋白在其中的作用十分重要。水通道廣泛存在于動植物以及微生物細胞膜上，它是具有特異性轉運水分子功能的通道，由一系列水通道蛋白組成，其中水通道蛋白5是促使水分子加快轉運的跨膜蛋白，水通道蛋白5與體內液體的運轉以及大多數腺體的分泌有著密切關系。杜泉［29］使用胸腔鏡下胸交感神經干切斷術（Endoscopic Thoracic Sympathectomy，ETS），于人體腋窩自然褶皺處取得皮膚標本，通過體外汗腺細胞培養(yǎng)檢測多汗癥患者腋窩汗腺水通道蛋白5（Aquapor in5，AQP5）的表達與定位，并通過建立人體汗腺細胞體外模型的實驗研究，發(fā)現(xiàn)汗腺AQP5蛋白表達增強可能與神經體液機制有關。

4　展望

瘢痕作為一個全球性的難題，一直以來深受整形外科醫(yī)生的重視，減少瘢痕的產生、加快瘢痕的愈合速度向來都是創(chuàng)面愈合研究的方向。皮膚附屬器作為附屬器再生或者瘢痕修復的主要細胞來源，起著舉足輕重的作用。缺乏汗腺的瘢痕愈合部位因為患者無法排汗來調節(jié)體溫，大大降低了其生活質量，因此汗腺細胞的研究也顯得十分迫切。

近幾年，利用干細胞技術誘導和移植技術來促進大面積燒創(chuàng)傷患者汗腺的修復和再生已取得了一定程度的進展，通過對干細胞和熱休克的汗腺細胞共培養(yǎng)，促進干細胞的分化體系已經非常成熟，對于汗腺的再生有著很大幫助。但是汗腺作為一個人體的小器官，其分離培養(yǎng)以及可以使用的傳代數可利用率比較低，這也是限制汗腺細胞研究發(fā)展的主要方面，本文主要是總結前人的經驗，希望可以為以后汗腺細胞的發(fā)展提供一定的幫助，進而造福因燒創(chuàng)傷后汗腺缺失導致生活質量下降的患者。

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Research progress of human sweat gland cells in trauma and repairCHEN Fu-huan，SONG Hui-feng，WANG Tong-ming，HE Xiu-ye，YUE Xiao-tong

CHEN Fu-huan，SONG Hu i-feng，WANG Tong-m ing，HEXiu-ye，YUEXiao-tong
（Departmentof Burn and Plastic Surgery，The First Affiliated Hosp ita lo f PLA GeneralHosp ital，Chinese PLAMedica lSchool，Beijing 100048，China）

Sweat g land，as the bod y's largest organ-the skin im portant appendages，p lays an important role in the human body.A large area of severely burned or trauma patients，because of the inab ility of evaporating through sweatg land，affects the quality of life o fpatients.Developmento f tissue engineering technology for large area of skin has p rovided a new method for skin defects，and got som e certain effec t.This paper，firstly w ith the help of literature research，introduces the basic form and func tion o f Sweat g land ce lls，Second ly to exp lore the re levant origina l ce ll d ifferentiation into sweat g land cells；introduced in detail epidermal stem cells（ESCs）and hum an umbilical cord mesenchym al stem cells（MSCs）to d ifferentiate into sweatg land cells，and its differentiation pathways such as MAPK、ERK and so on.then the expounds on the status quo of sweatg land cells in vitro；Finally analyzes the regeneration of sweatg land cells for skin trauma and repair.

sweat g lands；sweat g land cells；ep iderma lstem cells；mesenchym alstem cells；skin injury；repair

R641

A

1008-6455（2015）19-0073-04

2015-08-19

2015-09-29

編輯/李陽利

國家自然科學基金（編號：81171821）

陳甫寰，在讀研究生

宋慧鋒，主任醫(yī)師；主要研究方向：美容整形、瘢痕整形以及組織工程等方面；E-mai l：song_hui feng@126.com