單德鑫　李海統(tǒng)　黃河　等

摘要：從大慶不同利用類型的鹽堿土地區(qū)取土樣，經(jīng)馴化、分離篩選出兩株高效耐鹽菌，分別命名為A和B。經(jīng)形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)、掃描電鏡觀察和16S rDNA鑒定得知，菌種 A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），均為芽孢桿菌屬。經(jīng)過單因素試驗(yàn)，得出A、B的最適生長條件均為溫度30 ℃，pH 7～9，鹽濃度20%，這將為以后該地區(qū)微生物資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鹽堿土；高效耐鹽菌；分離；分子鑒定；生長特性

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5395-03

松嫩平原鹽漬土分布十分廣泛，是我國鹽漬化土壤的最大分布區(qū)，其地處半濕潤半干旱區(qū)，具有廣泛的閉流區(qū)和礦化度很高的無尾河，年降水量約450 mm[1]，該區(qū)鹽漬土主要分布在平原西部的半干旱和干旱地區(qū)，主要包括吉林西部的松原和白城地區(qū)，黑龍江的三肇、安達(dá)、大慶和齊齊哈爾等地區(qū)[2]。其中大慶的鹽堿化土地面積為13.69×104 hm2，占其土地總面積的28.3%[3]。土壤鹽漬化導(dǎo)致大量土壤資源喪失，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件惡化，嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的持續(xù)健康發(fā)展。因此本試驗(yàn)從大慶鹽堿地區(qū)取樣，分離篩選耐鹽菌種，對當(dāng)?shù)佧}堿土中微生物資源狀況進(jìn)行初步探索，為以后該地區(qū)微生物資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為研發(fā)更加成熟的菌劑提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

分別從大慶的鹽堿地區(qū)的農(nóng)田、農(nóng)田秸稈還田結(jié)合區(qū)、農(nóng)田休耕結(jié)合區(qū)、湖邊、堿泡地、石油區(qū)取得土樣，具體地點(diǎn)如表1所示。

培養(yǎng)基的組成如下。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 調(diào)至7.2～7.4。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。LB培養(yǎng)基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.2～7.4。所有培養(yǎng)基在121 ℃，0.1 Mpa下滅菌20 min備用[4]。

1.2 菌種的分離純化及篩選

將土壤樣本分為6組，每組各取0.1 g置于100 mL三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，加玻璃珠充分打散，于120 r/min搖床中培養(yǎng)3 d[5]。各取1 mL懸液稀釋濃度至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分別涂布到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，用劃線法純化培養(yǎng)，然后把已經(jīng)純化得到的菌種接種到NaCl濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%和32% 的牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基里[6-8]，置30 ℃下培養(yǎng)，觀察生長情況，以確定細(xì)菌耐鹽程度[9]。

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，通過對菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及相關(guān)生理生化試驗(yàn)，從而對菌種A、B進(jìn)行初步鑒定[10]，掃描電鏡觀察進(jìn)一步鑒定。而后進(jìn)行耐鹽菌的分子鑒定，即提取菌種的DNA，然后采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；BSR

1510/1492：5′-GGTTACCTTCTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL 10 × Buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP，2 μL BSF8/27 引物（0.1 nmol/μL），2 μL BSR1510/1492引物（0.1 nmol/μL），0.5 μL Taq酶（5 U/μL），1 μL模板DNA，35.5 μL雙蒸水。反應(yīng)條件如下：

94 ℃ 預(yù)變性 5 min

94 ℃ 變性 45 s

55 ℃ 退火 90 s

72 ℃ 延伸 2 min

72 ℃ 延伸 10 min

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化以及測序由上海生工完成。16S rDNA同源性比較與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析將所測得的序列于Genbank上進(jìn)行Blast比對，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

1.3 菌種的生長特性研究

為研究菌種的最適生長條件，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.1 溫度 向液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中接入2 mL菌懸液，分別在15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng)，均做3個平行試驗(yàn)，120 r/min振蕩24 h后，測定培養(yǎng)基內(nèi)菌液OD值。

1.3.2 pH 將菌懸液分別接入pH為3、5、7、9、12的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，其他條件同上，測定24 h后培養(yǎng)基內(nèi)菌液OD值。

1.3.3 鹽濃度 將菌懸液分別接入鹽濃度為10%、15%、20%、25%、30%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，其他條件同上，測定24 h后培養(yǎng)基內(nèi)菌液OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離純化及篩選

將取樣地樣本進(jìn)行初篩，共獲得34株菌。再經(jīng)富集培養(yǎng)、梯度稀釋的菌液涂布于篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其純化后轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～5 d。在平板培養(yǎng)基上選取高濃度區(qū)域以外分散的單菌落，根據(jù)菌落大小、形狀、顏色、隆起程度、表面光澤、透明程度、邊緣形狀和在高鹽濃度下生長情況等差別，最終分離出2株菌落，分別命名為菌種A、B。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種形態(tài)特征觀察 菌種A呈米黃色，菌體表面光滑并且濕潤，單一菌落形狀為長圓形，邊緣平滑，在液體培養(yǎng)基生長渾濁，容易被挑起，沒有菌膜形成，無沉淀。菌種B呈乳脂狀，呈現(xiàn)乳白色，透明，單一菌落形狀為圓形，邊緣為鋸齒狀，菌體表面光滑且濕潤，不容易被挑起；在液體培養(yǎng)基生長渾濁，沒有菌膜形成，無沉淀。

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進(jìn)行葡萄糖氧化產(chǎn)酸，在生長溫度測定試驗(yàn)中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產(chǎn)生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散，表示菌種均有運(yùn)動性。其他結(jié)果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數(shù)是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達(dá)到了99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達(dá)99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時(shí)，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時(shí)生長狀態(tài)良好，pH為3～5時(shí)生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時(shí)生長情況較好，pH為12時(shí)仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強(qiáng)酸的條件不適合菌種的生長，強(qiáng)堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時(shí)，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時(shí)，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時(shí)，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結(jié)與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經(jīng)一系列生理生化試驗(yàn)鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗(yàn)可知，菌種A、B最優(yōu)條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉興土.松嫩平原退化土地整治與農(nóng)業(yè)發(fā)展[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[2] 宋長春，何 巖，鄧 偉.松嫩平原鹽漬土壤生態(tài)地球化學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2003.

[3] 李取生，李秀軍，李曉軍，等.松嫩平原蘇打鹽堿地治理與利用[J].資源科學(xué)，2003（1）：17-22.

[4] 周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐鹽苯酚降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2013.

[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環(huán)境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細(xì)菌的分離及其生物學(xué)特性[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優(yōu)化研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學(xué)軟件應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.

（責(zé)任編輯 彭西甜）

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進(jìn)行葡萄糖氧化產(chǎn)酸，在生長溫度測定試驗(yàn)中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產(chǎn)生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散，表示菌種均有運(yùn)動性。其他結(jié)果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數(shù)是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達(dá)到了99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達(dá)99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時(shí)，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時(shí)生長狀態(tài)良好，pH為3～5時(shí)生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時(shí)生長情況較好，pH為12時(shí)仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強(qiáng)酸的條件不適合菌種的生長，強(qiáng)堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時(shí)，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時(shí)，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時(shí)，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結(jié)與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經(jīng)一系列生理生化試驗(yàn)鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗(yàn)可知，菌種A、B最優(yōu)條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐鹽苯酚降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2013.

[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環(huán)境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細(xì)菌的分離及其生物學(xué)特性[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優(yōu)化研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

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[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學(xué)軟件應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.

（責(zé)任編輯 彭西甜）

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進(jìn)行葡萄糖氧化產(chǎn)酸，在生長溫度測定試驗(yàn)中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產(chǎn)生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散，表示菌種均有運(yùn)動性。其他結(jié)果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數(shù)是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達(dá)到了99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達(dá)99%。根據(jù)比對結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。由分子鑒定結(jié)果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時(shí)，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時(shí)生長狀態(tài)良好，pH為3～5時(shí)生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時(shí)生長情況較好，pH為12時(shí)仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強(qiáng)酸的條件不適合菌種的生長，強(qiáng)堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時(shí)，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時(shí)，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時(shí)，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結(jié)與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經(jīng)一系列生理生化試驗(yàn)鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗(yàn)可知，菌種A、B最優(yōu)條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

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[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環(huán)境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細(xì)菌的分離及其生物學(xué)特性[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優(yōu)化研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：2091-2096.

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[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學(xué)軟件應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.

（責(zé)任編輯 彭西甜）