羅純　張青林　羅正榮

摘要：公共數(shù)據(jù)庫(kù)和柿轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的大量EST序列為開(kāi)發(fā)新的SSR標(biāo)記提供了有效資源。我們?cè)谇捌诶眠@些數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)出112個(gè)EST-SSR標(biāo)記，此次研究選用其中11個(gè)標(biāo)記對(duì)柿屬（Diospyros L.）15個(gè)種20份試材進(jìn)行了標(biāo)記通用性檢測(cè)。結(jié)果表明，所有引物均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，多態(tài)性引物比率達(dá)100%，并且UPGMA聚類(lèi)結(jié)果可靠，說(shuō)明柿EST-SSR標(biāo)記在近緣種中可以通用。上述通用性標(biāo)記為柿屬植物遺傳多樣性研究提供了標(biāo)記資源。

關(guān)鍵詞：柿屬植物（Diospyros L.）；EST-SSR標(biāo)記；通用性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.775.3；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5434-04

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)通常又稱(chēng)為微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellites），它是指以1～6個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯特性、易用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)、重復(fù)性強(qiáng)、數(shù)量豐富和對(duì)基因組有很好的覆蓋性等特點(diǎn)[1]。根據(jù)SSR的來(lái)源可將其分為基因組SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）-SSR。EST是來(lái)自隨機(jī)選取的特定處理的cDNA克隆末端序列，能反映mRNA的信息，在功能基因組研究中具有重要意義。EST-SSR與基因組SSR標(biāo)記相比，具有不同物種間通用性較好、開(kāi)發(fā)方法簡(jiǎn)單及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[2]。而且EST-SSR標(biāo)記來(lái)自于基因的編碼序列，更容易獲得基因表達(dá)的信息，所以現(xiàn)在已成為重要的農(nóng)作物農(nóng)藝性狀定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、比較基因組學(xué)研究的新型工具。目前，大麥（Hordeum vulgare L.）[3]、小麥（Triticum aestivum L.）[3]、油菜（Brassica campestris L.）[4]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[5]等許多農(nóng)作物已從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中成功地開(kāi)發(fā)出了大量的EST-SSR標(biāo)記。

柿（Diospyros kaki Thunb.）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros L.）植物中作為果樹(shù)栽培的代表種，其栽培歷史已有二千余年。中國(guó)是柿屬植物的分布中心和原產(chǎn)中心之一，擁有豐富的種質(zhì)資源。目前，已利用多種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)柿屬植物進(jìn)行了遺傳分析，如Du等[6]在柿上開(kāi)發(fā)了反轉(zhuǎn)座子標(biāo)記，Guo等[7]利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）技術(shù)開(kāi)發(fā)了SSR標(biāo)記。我們也開(kāi)發(fā)了EST-SSR和靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（Target region amplified polymorphism，TRAP）標(biāo)記[8，9]，并在柿品種間進(jìn)行了遺傳分析，但是這些標(biāo)記對(duì)于柿屬其他種植物是否能通用尚需進(jìn)一步試驗(yàn)。本研究利用前期開(kāi)發(fā)的11個(gè)EST-SSR標(biāo)記對(duì)柿屬15個(gè)種20份試材進(jìn)行了標(biāo)記通用性評(píng)價(jià)，旨在為柿及其近緣種種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析提供實(shí)用、高效的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料和模板DNA的提取

利用柿屬15個(gè)種的20份材料（表1）進(jìn)行標(biāo)記通用性評(píng)價(jià)。采用CTAB法提取材料基因組DNA，參照程運(yùn)江等[10]的方法并作適當(dāng)改動(dòng)。試驗(yàn)所用引物序列基本信息見(jiàn)表2。

1.2 擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括：1×Buffer，20 ng DNA 模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，0.8 μmol/L 引物，1 U Taq酶。擴(kuò)增反應(yīng)是在德國(guó)Biometra TProfessional PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，55 ℃（不同引物退火溫度不同）復(fù)性1 min，72 ℃延伸75 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。試驗(yàn)所用引物序列的基本信息及各引物退火溫度見(jiàn)表2。

1.3 凝膠電泳及銀染

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后進(jìn)行銀染[11，12]，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存電泳圖譜。根據(jù)圖譜分析各EST-SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增情況，包括是否擴(kuò)增、各位點(diǎn)在不同種中所得到的等位基因數(shù)量，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估算等位基因片段的大小。

1.4 遺傳多樣性分析

對(duì)11個(gè)柿EST-SSR位點(diǎn)在20份柿近緣種中的擴(kuò)增結(jié)果DNA譜帶進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，有帶的位置記為1，無(wú)帶的位置記為0。將所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Microsft Office Excel 2003軟件里進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用NTSYSpc 2.10e分析軟件構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣；在Simint程序下選擇Dice系數(shù)計(jì)算20份柿近緣種間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相應(yīng)的系統(tǒng)樹(shù)狀樹(shù)，通過(guò)聚類(lèi)劃分類(lèi)群來(lái)完成聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿EST-SSR引物在柿近緣種中的擴(kuò)增結(jié)果

11對(duì)柿EST-SSR引物在20份柿近緣種中的擴(kuò)增結(jié)果分別見(jiàn)表3、圖1。由表3可以看出，在所有的11對(duì)EST-SSR引物中，以引物1430、5845與5553的通用性最高，可在所有20份柿近緣種材料中得到擴(kuò)增片段；而其他8對(duì)引物都在某些材料中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，如引物460在麗江君遷子1以外的其他近緣種中都得到了擴(kuò)增產(chǎn)物；引物6665也有較高的通用性，除了在麗江君遷子1和麗江君遷子4中沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物外，在其他的近緣種中都得到了清晰的擴(kuò)增條帶。引物8125、4379和9004在3個(gè)近緣種中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。引物1554、6615、8917在4個(gè)近緣種中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，通用性稍低。

2.2 EST-SSR擴(kuò)增圖譜分析

對(duì)11個(gè)EST-SSR位點(diǎn)在20份柿屬植物中的擴(kuò)增圖譜（圖1）進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在擴(kuò)增與否和各位點(diǎn)擴(kuò)增的等位基因數(shù)量方面，不同種間存在著差異。從EST-SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增情況來(lái)看，麗江君遷子1除了引物1430、5845、8125和5553可得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物外，在其他7個(gè)位點(diǎn)中均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，可擴(kuò)增位點(diǎn)較少；烏材、麗江君遷子4和麗江君遷子6分別得到7、6、7個(gè)可擴(kuò)增位點(diǎn)；青茶柿、象牙樹(shù)、麗江君遷子3和苗山柿各自除一個(gè)位點(diǎn)外，其他10個(gè)位點(diǎn)均能有效擴(kuò)增；其他12份近緣種材料在所供試的EST-SSR位點(diǎn)均有目的產(chǎn)物擴(kuò)增出來(lái)。

從表3各EST-SSR位點(diǎn)所得到的等位基因數(shù)目來(lái)看，各近緣種所得到的等位基因數(shù)目差異較小。各個(gè)近緣種材料在8917、1430位點(diǎn)上擴(kuò)增得到的等位基因數(shù)較多，其中，嶺南柿在8917位點(diǎn)上得到等位基因數(shù)目最多，為8個(gè)。位點(diǎn)1554所表現(xiàn)的多態(tài)性較低，除黑皮柿和青茶柿分別擴(kuò)增出2個(gè)和3個(gè)等位基因外，所檢測(cè)的其他材料在該位點(diǎn)上表現(xiàn)為單態(tài)或無(wú)擴(kuò)增。

2.3 UPGMA聚類(lèi)分析

20份柿近緣種EST-SSR分析的UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，由于試驗(yàn)材料是柿屬中不同的種，除各類(lèi)君遷子外，其他種間的相似系數(shù)都比較低。所有材料中，最大的Dice相似系數(shù)為0.909（麗江君遷子3和麗江君遷子5之間），最小的為0.059（烏材和嶺南柿之間）。烏材與供試其他材料之間的相似系數(shù)均很小，說(shuō)明烏材與之的親緣關(guān)系都非常遠(yuǎn)，是否是個(gè)更古老的野生種，有待進(jìn)一步確認(rèn)。而各類(lèi)君遷子之間的親緣關(guān)系較近，聚在一起后與浙江柿相聚，說(shuō)明浙江柿是與君遷子親緣關(guān)系最近的一個(gè)近緣種。

3 小結(jié)與討論

為檢測(cè)在柿栽培種中開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物對(duì)其近緣種的通用性高低，我們利用11對(duì)EST-SSR引物，以20份柿近緣種為試材進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果這11對(duì)引物均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，且多態(tài)性引物比例為100%，表明柿EST-SSR引物對(duì)其近緣種是可通用的，而且顯示的多態(tài)性頻率很高。EST-SSR標(biāo)記引物是根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的，因此側(cè)翼序列的保守程度決定著EST-SSR引物在不同種間的通用性。試驗(yàn)中，不同EST-SSR引物的通用性不同，引物1430、5845與5553在所有20份柿近緣種材料中都能成功擴(kuò)增，而引物1554、6615、8917在4個(gè)近緣種中無(wú)目的擴(kuò)增產(chǎn)物，這很可能就是它們各自對(duì)應(yīng)EST-SSR的側(cè)翼序列的保守程度不同所造成的。

20份柿近緣種的UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果表明，供試的EST-SSR標(biāo)記在種間進(jìn)行遺傳分析是比較可靠的。比如各類(lèi)君遷子屬于同一個(gè)種，它們能夠很好地聚在一起，并且與浙江柿親緣關(guān)系較近，此結(jié)果與前人研究的一致[13]。

與基因組SSR標(biāo)記相比，由于EST-SSR來(lái)源于基因組編碼序列，其保守程度更高，因此比基因組SSR具有更高的種間通用性[2，14，15]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)可以產(chǎn)生海量的EST序列，這為大量開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記提供了充足的序列來(lái)源。試驗(yàn)前期分別利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)及自主轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的柿EST序列開(kāi)發(fā)了100余個(gè)EST-SSR標(biāo)記，根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，柿EST-SSR標(biāo)記具有很高的種間通用性，這就有效地彌補(bǔ)了柿近緣種分子標(biāo)記的不足，提高了該標(biāo)記的利用價(jià)值，為柿近緣種的種質(zhì)鑒定及遺傳分析等研究工作提供了標(biāo)記資源。

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（責(zé)任編輯 王 珞）

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