龍　綺，李春林，蔡篤程，劉　碩，謝偉偉，孟　光

(?？谑腥嗣襻t(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海口 570208)

目前，過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)常用的診斷方法有血清特異性IgE檢測(cè)(specific IgE，sIgE)、皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skin prick test，SPT)、血清吸入性過敏原過篩試驗(yàn)(Phadiatop)等[1]。本研究分析海南省重要過敏原蜉蝣臨床皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性率，選擇SPT陽(yáng)性患者進(jìn)行鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)，并觀察其陽(yáng)性反應(yīng)，另選擇蜉蝣過敏原SPT試驗(yàn)陽(yáng)性血液進(jìn)行體外嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)，比較這3種方法結(jié)果是否相符。

對(duì)象和方法

對(duì)象

研究對(duì)象為2009年1月1日至2014年12月31日在?？谑腥嗣襻t(yī)院就診的AR患者，所有患者均有不同程度的鼻癢、打噴嚏、流鼻涕、鼻塞，部分有眼結(jié)膜充血、流淚等癥狀。AR診斷符合《過敏性鼻炎診療綱要2008》及我國(guó)AR指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。行SPT前1周內(nèi)未使用抗組胺類藥物或糖皮質(zhì)激素。

方法

AR患者進(jìn)行蜉蝣過敏原SPT。選擇30例蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性(++)以上患者進(jìn)行鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)；30例蜉蝣過敏原SPT陰性健康志愿者為對(duì)照。另選30例蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性(++)以上患者進(jìn)行嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)；30例SPT陰性健康志愿者血液為對(duì)照。所有研究對(duì)象均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

材料

皮膚試驗(yàn)過敏原由北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。皮試液包括螨蟲、霉菌、花粉、蜉蝣、過敏原溶媒陰性對(duì)照液和組胺陽(yáng)性對(duì)照液等20種。組胺檢測(cè)試劑盒由丹麥Feflab公司生產(chǎn)。

皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)

方法：SPT參照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行?；颊呷∽?，手臂放松平放于桌面，用75%酒精消毒前臂掌側(cè)皮膚兩遍，再用蒸餾水將皮膚擦干凈。待皮膚自然晾干后，將18種過敏原點(diǎn)刺液及陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液按照2 cm的間隔縱向排列兩行滴在前臂，用點(diǎn)刺針的尖端垂直于皮膚，穿過點(diǎn)刺液，刺入皮內(nèi)，停留大約1 s，點(diǎn)刺后20 min觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：以過敏原與組胺陽(yáng)性對(duì)照液所致風(fēng)團(tuán)面積對(duì)比確定其反應(yīng)級(jí)別。以組胺陽(yáng)性對(duì)照直徑為基準(zhǔn)：(1)無風(fēng)團(tuán)、紅暈反應(yīng)小于組胺陽(yáng)性對(duì)照的1/3為陰性(-)；(2)風(fēng)團(tuán)為組胺陽(yáng)性對(duì)照1/2，紅暈≤陽(yáng)性對(duì)照者為(+)；(3)風(fēng)團(tuán)等于組胺陽(yáng)性對(duì)照，紅暈>陽(yáng)性對(duì)照者為(++)；(4)風(fēng)團(tuán)和紅暈均>陽(yáng)性對(duì)照1倍者(+++)；(5)風(fēng)團(tuán)和紅暈>組胺陽(yáng)性對(duì)照2倍以上，并有偽足者為(++++)。本研究以(+++)和(++++)統(tǒng)計(jì)強(qiáng)陽(yáng)性率。

鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5]方法，取1 cm邊長(zhǎng)方形濾紙片，試驗(yàn)組滴入1∶100蜉蝣過敏原皮試液1滴浸濕濾紙片，對(duì)照組滴入注射用水1滴。受試者取坐位，試驗(yàn)前進(jìn)行鼻部拍照，將濾紙片放入一側(cè)鼻腔下鼻甲前部外側(cè)面，鼻腔放入濾紙片后開始計(jì)時(shí)，一般觀察5～15 min。陽(yáng)性反應(yīng)癥狀表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、黏液鼻涕增加，以及眼癢、流淚等；嚴(yán)重者可誘發(fā)哮喘發(fā)作；體檢可發(fā)現(xiàn)鼻黏膜灰白水腫及分泌物增多。為預(yù)防哮喘發(fā)作，檢查現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)準(zhǔn)備必需的急救藥物和設(shè)備。

嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)

血樣準(zhǔn)備：采用患者檢測(cè)血清學(xué)IgE血樣，肝素抗凝靜脈血3 ml，離心(2 000 r/min)10 min，上清用于檢測(cè)總IgE，剩下部分加入上清等量稀釋液后混勻，取2 ml血樣和1 ml稀釋液分別加入包被有白細(xì)胞介素-3的試管中混勻，成為待檢血樣。陰性對(duì)照血樣按同樣方法準(zhǔn)備。

過敏原提取液準(zhǔn)備：取蜉蝣0.1 g，按1∶10比例加入試劑盒內(nèi)稀釋液，室溫震蕩提取30 min，離心取上清。按試劑盒操作說明將提取液按濃度梯度稀釋待用。在已包被了玻璃纖維檢測(cè)板的每孔中按稀釋梯度加入25 μl過敏原提取液，之后按操作說明每孔加入待檢血樣和對(duì)照血樣25 μl，置37℃溫箱孵育60 min，取出洗板；在每孔中加150 μl的SDS wash buffer，37℃孵育30 min后取出洗板；最后在每孔中加75 μl熒光劑，室溫下放置10 min，每孔中再加入75 μl終止液，檢測(cè)系統(tǒng)校準(zhǔn)后上機(jī)檢測(cè)，通過測(cè)定熒光物質(zhì)熒光值來測(cè)定組胺的濃度。

結(jié)果判定：結(jié)果依據(jù)被檢過敏原激發(fā)患者嗜堿性粒細(xì)胞后產(chǎn)生組胺水平而判讀為陽(yáng)性和陰性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性率，嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)各組間陽(yáng)性率采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

基線資料

共收集AR患者2 078例，年齡為5～65歲，平均(35.2±11.8)歲；男1 169例，女909例；發(fā)病時(shí)間為1～30年。進(jìn)行鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)的30例蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性(++)以上患者年齡15～55歲，男13例，女17例，發(fā)病時(shí)間2～30年。30例SPT陰性健康志愿者年齡15～50歲，男14例，女16例。進(jìn)行嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)的30例蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性(++)以上患者年齡12～50歲，男12例，女18例，發(fā)病時(shí)間5～20年；30例SPT陰性健康志愿者年齡10～45歲，男14例，女16例。

蜉蝣過敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果

2078例AR患者蜉蝣過敏原SPT陰性者741例，陽(yáng)性者1 337例，陽(yáng)性率64.34%。其中(+)415例，(++)656例，(+++)227例，(++++)39例；(+++)和(++++)共266例，強(qiáng)陽(yáng)性率為12.80%。

鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果

30例SPT陽(yáng)性患者均在3～5 min內(nèi)出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、鼻塞，5例出現(xiàn)眼結(jié)膜充血、流淚等癥狀，未出現(xiàn)哮喘癥狀，陽(yáng)性率為100.00%。30例陰性對(duì)照者在觀察的15 min內(nèi)均未出現(xiàn)陽(yáng)性癥狀。

嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

30例SPT陽(yáng)性患者嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率為86.67%(26/30)，30例對(duì)照者嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率為6.25%(2/30)。2組陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.3，P<0.05)。

討　　論

AR主要由致敏物質(zhì)進(jìn)入鼻腔，使鼻腔黏膜與相應(yīng)的IgE結(jié)合而引起的一種過敏反應(yīng)性疾病，屬IgE介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)，可引起多種并發(fā)癥。近10年來AR患病率明顯增加，大約影響到全球10%～25%的人群，尤其在工業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家其患病率更高[6]。但在不同的地區(qū)，由于環(huán)境和物種的不同，引起AR的過敏原也存在較大差異。

蜉蝣目(Ephemeroptera)通稱蜉蝣，具有古老而特殊的性狀，是最原始的有翅昆蟲，主要分布在熱帶至溫帶的廣大地區(qū)。全世界已知有2 100余種，中國(guó)已知有100余種。常見的有蜉蝣科(Ephemeridae)和四節(jié)蜉蝣科(Baetidae)[4]。稚蟲水生，蜉蝣是魚類的重要餌料，成蟲不取食，存活期1～7 d，死后尸體風(fēng)干碎屑隨風(fēng)漂散于空氣中，可致呼吸道過敏。海南省是我國(guó)位于亞熱帶與熱帶地區(qū)的省份，雨量豐沛、河流湖泊等水域?qū)拸V且水質(zhì)優(yōu)良，為蜉蝣的生長(zhǎng)繁殖提供了廣闊的空間，同時(shí)海南省也是漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖大省，所以海南地區(qū)居民吸入或者接觸到蜉蝣過敏原概率也較高[7]。

AR的診斷多以典型病史、鼻腔檢查及過敏原的檢測(cè)為主要依據(jù)，過敏原的檢測(cè)中SPT由Lewis和Grant在1926年首先描述。因其操作簡(jiǎn)便、快速，且靈敏度、特異度以及重復(fù)性較好而被廣為應(yīng)用，并逐漸成為最重要的診斷方法，SPT在臨床尤其是門診AR的初步診斷中更具有價(jià)值和意義[8]。鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)是模擬自然發(fā)病條件，將可疑的過敏原或介質(zhì)直接放置于鼻腔黏膜，引起一系列的病理生理學(xué)反應(yīng)，從而確定特異性過敏原的試驗(yàn)。激發(fā)試驗(yàn)是診斷過敏性疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一，但過敏原體內(nèi)激發(fā)試驗(yàn)對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)性大，合作性差，不易被接受[9]。另外，因國(guó)內(nèi)尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化過敏原，而國(guó)外產(chǎn)品進(jìn)入我國(guó)品種單一，無地域性的特殊種類(如蜉蝣過敏原)，使體內(nèi)試驗(yàn)受到嚴(yán)重限制。

體外血清學(xué)特異性IgE檢測(cè)是令致敏物質(zhì)與血清中的IgE結(jié)合，根據(jù)其濃度判斷是否對(duì)致敏物質(zhì)過敏，但是血清中其他原因產(chǎn)生的IgE(如寄生蟲等)也可被計(jì)算在內(nèi)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)是用過敏原激發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞，引起嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺，對(duì)組胺進(jìn)行檢測(cè)，確定患者是否對(duì)該物質(zhì)過敏。嗜堿性粒細(xì)胞在國(guó)外已成為一種廣泛應(yīng)用于臨床的體外過敏原檢測(cè)方法，主要用于診斷吸入性過敏原、食物過敏原、真菌、藥物及洗滌劑過敏[10-12]。為此，本研究選擇30例臨床蜉蝣過敏原SPT陽(yáng)性的患者血液(去除血清)進(jìn)行嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與SPT、鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果比較，3種方法結(jié)果相符。特異性IgE檢測(cè)受過敏原品種的限制，有些當(dāng)?shù)靥厥獾闹旅粑镔|(zhì)無法檢測(cè)，利用Histareader 501儀器及試劑盒，將其制備后放入試劑盒，檢測(cè)組胺釋放量，協(xié)助診斷，突破了皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)及血清學(xué)sIgE檢測(cè)過敏原種類較少的限制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)未經(jīng)純化或不能純化的抗原或不能應(yīng)用于臨床的抗原進(jìn)行檢測(cè)的目標(biāo)。

綜上所述，蜉蝣過敏原的3種檢測(cè)方法結(jié)果相符。嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便、易行、準(zhǔn)確性高，在體內(nèi)試驗(yàn)遇到瓶頸的時(shí)期，不失為一種檢測(cè)地域性過敏原的好方法。

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