王國正，郭成金，馬欣燕 (天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387 )

正交設(shè)計法篩選玉蕈菌絲體液體培養(yǎng)基

王國正，郭成金*，馬欣燕 (天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387 )

[目的] 篩選適宜玉蕈菌絲體生長的液體培養(yǎng)基。[目的]以菌絲體生物量為主要指標，采用單因素方法篩選菌絲體生長最佳碳氮源，再進行正交試驗篩選其碳源與氮源最佳配比，進一步采用單因素方法篩選其最佳無機鹽及VB1濃度配比。[結(jié)果]玉蕈菌絲體最佳液體培養(yǎng)基為麥芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麥麩10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然。25 ℃培養(yǎng)288 h，其菌絲體生物量干重可達10.394 g/L。[結(jié)論]該研究為玉蕈菌絲體深層發(fā)酵生產(chǎn)及其液體菌種的生產(chǎn)與應(yīng)用提供技術(shù)支持。

玉蕈；液體培養(yǎng)基；菌絲體；生物量；單因素；正交設(shè)計

玉蕈[Hypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw]又名斑玉蕈，隸屬于離褶傘科(Lyophyllaceae)玉蕈屬(Hypsizigusmarmoreus)[1]。玉蕈又稱為蟹味菇、真姬菇、膠玉蘑、鴻喜菇、海鮮菇、松茸菇、靈芝菇、偏耳等[2]，是一種大型木質(zhì)腐生真菌。玉蕈是一種生長在北溫帶的大型食用蕈菌，自然分布在北美、歐洲、西伯利亞和日本等地區(qū)。20世紀80年代中期由日本引入我國遼寧、福建、山西等省[3]。

玉蕈的營養(yǎng)成分豐富，含有多種生物活性物質(zhì)，是一種低熱量、高蛋白、低脂肪的保健食品。目前，已經(jīng)在河北、河南、山東、山西、上海和福建等省(市)進行了推廣栽培[3]，并實現(xiàn)了較大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)[4]。玉蕈菌絲生長速度較其他蕈菌慢，培育時間長[5]。目前，對玉蕈菌絲體液體培養(yǎng)條件的篩選研究較少。筆者采用正交試驗方法，對玉蕈所需各營養(yǎng)成分進行了探究，為玉蕈菌絲體深層發(fā)酵生產(chǎn)及其液體菌種的生產(chǎn)與應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種供試玉蕈，由天津師范大學(xué)蕈菌研究所提供。

1.2 試驗試劑試驗試劑為蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、VB1、瓊脂(天津市珠江衛(wèi)生材料廠)，以上除注明外均購于生工生物，試劑均為分析純。馬鈴薯、麥麩為市售。

1.3 儀器與設(shè)備YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器(山東新華醫(yī)療器械廠)；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；BS224S電子分析天平(Sartorius)；LRH-150-G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)；AP-01D 真空泵(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1PDA綜合培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB14.0 mg/L、瓊脂20 g/L。

1.4.2碳源初篩培養(yǎng)基。酵母粉3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L。分別以馬鈴薯200 g/L、蔗糖20 g/L、葡萄糖20 g/L、乳糖20 g/L、麥芽糖200 g/L為供試碳源。

1.4.3氮源初篩培養(yǎng)基。蔗糖20 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L。分別以麥麩30 g/L、酵母粉3 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸銨3 g/L、硝酸銨3 g/L為供試氮源。

1.5 試驗方法

1.5.1菌種活化及菌絲體液體培養(yǎng)。將菌種提前活化后接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃暗培養(yǎng)14 d。從平板中選取生長健壯的菌絲體前端，挑取0.5 cm2的菌種接種塊，接種于廣口錐形瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶5塊。25 ℃靜置暗培養(yǎng)120 h，之后放入旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)168 h。每個水平3次重復(fù)。

1.5.2菌絲體干重測定。將培養(yǎng)288 h的玉蕈菌絲體進行抽濾，80 ℃烘干至恒重，稱量菌絲體干重并記錄。

1.5.3碳、氮源培養(yǎng)基正交試驗。根據(jù)碳氮源單因素初篩的試驗結(jié)果，從中各選取2個較好的碳氮源，按L9(34)設(shè)計4因素3水平正交試驗復(fù)篩，與KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L組成9個試驗配方，篩選出最佳碳氮源組合。正交因素與水平如表1所示。9個試驗配方如表2所示。

表1 正交試驗因素和水平 g/L

表2 碳氮源正交試驗設(shè)計 g/L

1.5.4無機鹽及維生素水平試驗。根據(jù)上述碳氮源正交試驗結(jié)果，篩選出最佳的碳氮源組合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入不同濃度梯度的KH2PO4，MgSO4·7H2O和VB1，組成無機鹽和維生素的單因素培養(yǎng)基。無機鹽和VB1因素水平試驗設(shè)計如表3。

表3 無機鹽和VB1因素水平試驗設(shè)計

1.5.5培養(yǎng)基篩選驗證試驗。對上述各成分篩選結(jié)果進行整理綜合，配成目標培養(yǎng)基，驗證試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉蕈菌絲體對碳源的利用碳源是蕈菌培養(yǎng)基的基本組成成分，為其合成胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和各種代謝產(chǎn)物以及儲藏物質(zhì)提供原料，也是某些大分子物質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)骨架[6]。從表4可知，玉蕈既可以利用單糖和雙糖，又可以利用多糖。其中以麥芽糖最好，乳糖最差。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方差分析F值是5.401，小于F4，10，0.01=5.994，大于F4，10，0.05=3.478[7]，說明不同的碳源對玉蕈菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異不顯著，在0.05水平上差異顯著。應(yīng)用Duncan’s檢測法分析表明在0.05水平上5種碳源中的葡萄糖和乳糖之間差異不顯著，馬鈴薯和蔗糖之間差異不顯著，但2組與麥芽糖之間差異顯著。為獲得最佳碳源配方，最終選取麥芽糖和蔗糖作為碳源進行正交試驗。

表4 不同碳源對玉蕈菌絲體生物量的影響

2.2 玉蕈菌絲體對氮源的利用氮源是微生物不可缺少的營養(yǎng)元素，為核酸、蛋白質(zhì)和各種酶類的合成提供原料[8]。從表5可知，玉蕈既可以利用有機氮源，也可以利用無機氮源。其中以酵母粉最佳，硫酸銨最差?？梢娪褶?yōu)先利用有機氮源。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方差分析表明F值是28.433，大于F4，10，0.01=5.994[7]，說明不同氮源對玉蕈菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異極顯著。應(yīng)用Duncan’s檢測法分析表明在0.01水平上麥麩和蛋白胨之間差異不顯著，但和酵母粉、硫酸銨、硝酸銨之間差異顯著。為獲得最佳氮源配方，最終選擇酵母粉和麥麩作為氮源進行正交試驗。

表5 不同氮源對玉蕈菌絲體生物量的影響

2.3 碳氮源正交試驗結(jié)果由L9(34)正交試驗結(jié)果(表6)表明，在4個因素中，麥芽糖的極差(R)最大，麥麩的極差最小。極差越大，表明該因素的變化對試驗結(jié)果的影響程度越大[9]。因此麥芽糖對玉蕈菌絲體生物量的影響最大，麥麩影響最小。4個因素中各自的3個不同水平使得平均值(K)也不同，即K1、K2和K3，同一因素下K值越大表明在該水平上培養(yǎng)條件越好。比較各因素下不同水平的K值得到，麥芽糖、蔗糖和酵母粉在第3個水平上，麥麩在第1個水平上，玉蕈菌絲體長勢最好，生物量最高，因此玉蕈菌絲體液體培養(yǎng)基的碳、氮源最佳配方是A3B3C3D1，即麥芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麥麩10 g/L。

表6 碳氮源正交直觀分析 g/L

2.4 無機鹽及VB1濃度對玉蕈菌絲體生物量的影響無機鹽和VB1是微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，但所需量很少，對蕈菌菌絲體生物量的影響程度不及碳源和氮源。無機鹽提供了細胞物質(zhì)合成的主要元素，對新陳代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用，濃度過高或過低都會影響新陳代謝[10]。VB1是輔酶的組成成分或發(fā)揮輔酶的作用，對蕈菌的代謝活動起到調(diào)節(jié)作用。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析F值是2.238，小于F3，8，0.05=4.066[7]，說明不同濃度的無機鹽和VB1對玉蕈菌絲體生物量的影響在0.05水平上差異不顯著。此時可考慮各組生物量的均值，由表7可知，無機鹽和VB1的最佳配比是處理①，即KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L。

表7 無機鹽及VB1濃度對玉蕈菌絲體生物量的影響

2.5 培養(yǎng)基驗證結(jié)果按照上述試驗結(jié)果配置培養(yǎng)基(麥芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麥麩10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然)，接種，25 ℃靜置暗培養(yǎng)120 h，之后放入旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)168 h。抽濾烘干至恒重，玉蕈菌絲體生物量干重可達10.394 g/L，基本大于試驗中所測菌絲體生物量，因此該培養(yǎng)基是最佳培養(yǎng)條件。

3 結(jié)論

(1)試驗發(fā)現(xiàn)，接種后，菌塊浮于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基渾濁(圖1a)；靜置暗培養(yǎng)120 h后，菌塊周圍及培養(yǎng)基中出現(xiàn)絮狀菌絲，培養(yǎng)基較渾濁(圖1b)；搖床培養(yǎng)168 h后培養(yǎng)基澄清，出現(xiàn)大小不等的菌絲體球，且菌絲體貼壁生長(圖1c)。

(2)試驗結(jié)果表明，玉蕈最佳液體培養(yǎng)基為麥芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麥麩10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然。25 ℃靜置暗培養(yǎng)120 h，之后放入旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)168 h，玉蕈菌絲體生物量干重可達10.394 g/L。

[1] 郭成金.蕈菌生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2014: 203.

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Selection on Liquid Culture Medium for Mycelium ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw by Orthogonal Design

WANG Guo-zheng，GUO Cheng-jin*，MA Xin-yan

(College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387)

[Objective] In order to select the optimal liquid medium suitable for mycelium ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw .[Method] Adopting mycelial biomass ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw as major index, firstly the optimum carbon and nitrogen source ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw were used in the single factor test, and then carrying out the orthogonal test for the different concentrations of carbon and nitrogen source. Further, filtrating the optimum inorganic salt and VB1were used in the single factor test. [Result] The test result showed that the optimum liquid medium of mycelium composition ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw were maltose 30 g/L,sucrose 30 g/L, yeast extract 3 g/L, wheat bran 10 g/L, KH2PO41 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, VB19.0 mg/L, natural pH. Culturing for 288 hours at 25 ℃. The mycelial biomass dry weight ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw reached 10.394 g/L.[Conclusion] It provided technical support for the deep fermentation ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw mycelium and the production and application of liquid spawn.

Hypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw; Liquid culture media; Mycelium; Biomass; Single factor; Orthogonal design

王國正(1990-)，男，河北唐山人，碩士研究生，研究方向：蕈菌生物學(xué)。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事植物細胞營養(yǎng)及蕈菌生物學(xué)研究。

2015-03-25

S 646；Q93-335

A

0517-6611(2015)14-042-03