■董茂鋒 楊海鋒 白 冰 韓 薇 饒欽雄 趙志輝

（上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所上海市飼料監(jiān)督檢測站，上海 201403）

目前食用香料被廣泛應用于社會各個方面，且種類繁多，歐盟允許使用的食用香料物質(zhì)約2 800多種[1]，CAC的JECFA(食品添加劑聯(lián)合專家委員會)已評價約1 800種[2]，美國GRAS24名單中允許使用的有約2 600種。在農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2008）》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1126號）規(guī)定了作為食品用的香料允許在養(yǎng)殖動物中使用。香芹酚和百里香酚作為目前應用最為廣泛的重要香料之一，被廣泛應用于飼料添加。隨著香芹酚和百里香酚的生產(chǎn)技術(shù)提高以及其在飼料工業(yè)中所具有的優(yōu)勢，作為飼料調(diào)味劑香芹酚和百里香酚在飼料生產(chǎn)中的應用日益廣泛[3-4]。

目前國內(nèi)外對于香芹酚和百里香酚的研究主要集中在對各種細菌、病毒以及螨類等微生物的抑制研究，而關于飼料以及飼料添加劑中的化學分析報道比較缺乏。楊希國等建立了簡單的未凈化的測定香芹酚和百里香酚的液相色譜方法[5]。但是采用氣相色譜法的檢測方法未見報道，本文采用了分散固相萃取的前處理凈化方式測定飼料中香芹酚和百里香酚，分析方法簡便可靠，且檢出限遠低于目前報道的50 mg/kg。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

TRACE 2000火焰離子化檢測器的氣相色譜儀(美國Thermo公司)；Agilent DB-17ms色譜柱（30.0 m×0.32 mm× 0.25 μm；美國Agilent公司）；Agilent HP-5ms色譜柱（30.0 m×0.32 mm× 0.25 μm；美國Agilent公司）；MS 2渦旋混勻器（德國IKA）；超聲儀（KUDOS公司）；回旋震蕩器（中國翔天）；R-210帶水浴加熱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國BUSHI公司）；11-R高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)；吸附材料，氧化鋁、C18、GCB(石墨化炭黑)、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）、二氧化硅（中國Agela公司）；甲醇、異丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、乙腈和無水硫酸鈉為分析純（中國國藥）；乙酸乙酯色譜純；香芹酚和百里香酚標準品（純度≥98%，購買于SIGMA），稱取適量上述標準品用色譜純乙酸乙酯配置成質(zhì)量濃度為1 000 mg/l標準儲備溶液。飼料樣本均為上海本地生產(chǎn)飼料。

1.2 氣相色譜條件

載氣：N2；流速：2.0 ml/min；升溫程序：70 ℃以25℃/min升至130℃，再以35℃/min升至250℃，保持3 min；進樣口溫度230℃；檢測器溫度300℃；空氣流量：380 ml/min；：氫氣流量：40 ml/min；進樣量：1 μl。百里香酚和香芹酚保留時間分別是7.7、8.0 min(見圖1)。

圖1 香芹酚和百里香酚的氣相色譜

1.3 樣品的提取

稱取約 8 g試樣（精確至0.01 g），置入 50 ml離心管中，準確加入20 ml乙酸乙酯，超聲提取90 min，4 000 r/min離心1 min，待凈化。

1.4 樣品的凈化

取1.0 ml提取液于存有50 mg無水硫酸鈉、50 mg PSA、50 mg GCB的2 ml離心管，渦旋混合30 s，經(jīng)濾膜過濾，裝進樣小瓶，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

合適的提取溶劑決定了對香芹酚和百里香酚的提取效果，試驗首先考察了8種常規(guī)有機溶劑的提取效果，通過在超聲提取作用下，比較甲醇、異丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇和乙腈的提取效率。試驗采用香芹酚和百里香酚的添加劑為飼料樣本對象，觀察超聲提取30、60、90、120、150、180 min和210 min內(nèi)，香芹酚和百里香酚的含量變化，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2和圖3顯示，正己烷和乙酸乙酯對百里香酚和香芹酚的提取效果最好，正己烷為提取溶劑時，香芹酚和百里香酚的最高含量分別是0.27%和0.252%，乙酸乙酯為提取溶劑時，分別是0.27%和0.257%。在提取時間方面，超聲提取前90 min，香芹酚和百里香酚的含量隨著提取時間增加而增加，在90～210 min超聲提取階段，香芹酚和百里香酚含量無明顯變化。以上說明在超聲提取下，正己烷和乙酸乙酯的提取效果高于其余7種有機溶劑，且90 min為超聲提取的最佳時間。

圖2 不同有機溶劑對香芹酚的提取效果

圖3 不同有機溶劑對百里香酚的提取效果

2.2 超聲提取和震蕩提取的比較

在以上試驗結(jié)果基礎上，考察了正己烷和乙酸乙酯在超聲提取和在3 min渦旋提取兩種提取手段下對香芹酚和百里香酚的提取效果。試驗以香芹酚和百里香酚飼料添加劑為試驗對象，比較在兩種提取方法和兩種溶劑下，目標化合物的提取效果，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲提取和渦旋提取的比較

由圖4可知，超聲提取效果明顯高于渦旋提??；采用超聲提取時，正己烷與乙酸乙酯的提取效果無明顯差異，使用正己烷超聲提取時，香芹酚和百里香酚的含量分別為0.265%和0.248%，使用乙酸乙酯超聲提取時，香芹酚和百里香酚的含量分別為0.257%和0.245%。綜上所述，香芹酚和百里香酚的最佳的提取溶劑為乙酸乙酯和正己烷，超聲提取90 min即可。

2.3 凈化方式確立

2.3.1 吸附材料的影響

試驗采用了改良后的QuEChERS方式作為去除雜質(zhì)的凈化手段，首先考察了提取溶劑為正己烷和乙酸乙酯時，氧化鋁、C18、GCB(石墨化炭黑)、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）、二氧化硅五種常用吸附材料對香芹酚和百里香酚的吸附作用。吸附材料分別為50、100 mg和200 mg時，凈化后香芹酚和百里香酚的回收率變化，比較凈化吸附材料對目標化合物的影響。圖5～圖6是分別使用正己烷、乙酸乙酯為溶劑的香芹酚和百里香酚回收率。由圖5可知，當溶劑為正己烷時，PSA和二氧化硅對百里香酚和香芹酚有明顯的吸附作用，隨著吸附材料的增加，香芹酚和百里香酚回收率有下降趨勢，吸附材料量從50 mg增加到200 mg的過程中，香芹酚和百里香酚的平均回收率分別為5.35%～4.57%（PSA）、75.84%～61.32%(二氧化硅)和4.84%～3.98%（PSA）、79.03%～59.62%(二氧化硅)；隨著GCB的增加，香芹酚和百里香酚的回收率下降明顯，分別下降13.69%和9.82%；而氧化鋁和C18對目標化合物的吸附較少，香芹酚和百里香酚的回收率在92.08%～93.73%之間，當吸附材料50 mg增加到200 mg時，其變化都低于10%。

圖6是以乙酸乙酯為提取溶劑時，香芹酚和百里香酚的回收率隨著吸附材料質(zhì)量變化趨勢圖。隨著吸附材料質(zhì)量的增加，香芹酚和百里香酚的回收率都有不同程度的降低，但是五種吸附材料對兩種香料的吸附較少，回收率在80.67%～109.39%之間，其中GCB對香芹酚和百里香酚的吸附較其它四種吸附材料大，分別降低23.49%和25.57%，其余四種吸附材料中，下降在10%以內(nèi)。

圖5 提取溶劑為正己烷時香芹酚和百里香酚的回收率

圖6 提取溶劑為乙酸乙酯時香芹酚和百里香酚的回收率

綜上所述，乙酸乙酯為溶劑時，吸附材料對香芹酚和百里香酚的吸附效率較小，明顯優(yōu)于正己烷為溶劑時吸附材料對香芹酚和百里香酚的吸附作用；但是GCB的量改變對香芹酚和百里香酚的影響較大，建議凈化時適當降低GCB的用量。

2.3.2 吸附效果的影響

依據(jù)2.3.1節(jié)試驗結(jié)果，選擇8種不同飼料，考察以乙酸乙酯為溶劑時吸附材料的凈化效果以及對香芹酚和百里香酚的吸附效果。試驗結(jié)果顯示，GCB對去除飼料中的色素類雜質(zhì)具有明顯效果。從色譜圖的空白對照比較發(fā)現(xiàn)，除PSA對有些雜質(zhì)有吸附外，其余四種吸附材料無明顯效果。

綜上所述，試驗確定了以50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg無水硫酸鈉（除水作用）的凈化方式；由于正己烷的弱極性在凈化后容易引起香芹酚和百里香酚的損失，結(jié)合樣品提取條件的結(jié)論，試驗確定了20 ml乙酸乙酯為提取溶劑。

2.4 基質(zhì)效果的選擇

由于在采用帶火焰離子化檢測器的氣相色譜檢測過程中，純?nèi)軇┑臉藴饰镔|(zhì)和樣品的溶液條件不同而會引發(fā)基質(zhì)效應的產(chǎn)生。試驗考察了香芹酚和百里香酚的基質(zhì)效應，通過在空白樣本中加入香芹酚和百里香酚的標樣，計算基質(zhì)標樣與溶劑標樣的差值，評價香芹酚和百里香酚的基質(zhì)效應。按照η=（Ai/As）基質(zhì)標樣/（Ai/As）溶劑標樣公式計算。試驗結(jié)果顯示在十種飼料樣本中香芹酚和百里香酚的基質(zhì)效應平均η在0.935～0.981范圍內(nèi)，數(shù)值均接近1，說明基質(zhì)效應不明顯，對氣相色譜儀測定結(jié)果不產(chǎn)生顯著影響。

2.5 方法的準確度和精確度測定

選用10種常見的飼料樣本，分別是魚料配合料(A)、仔豬配合料(B)、貓料配合料(C)、仔雞配合料(D)、乳豬濃縮料(E)、畜禽濃縮料(F)、仔豬濃縮料(G)、豬預混料(H)、雞預混料(I)和魚預混料(J)作為基質(zhì)做添加回收試驗。試驗選擇了三個添加水平（10、100、200 mg/kg），每個樣本三個平行，結(jié)果見表1。試驗結(jié)果顯示10種飼料中香芹酚和百里香酚的添加回收率在77.97%～104.04%之間，RSD在0.63%～9.92%之間。

表1 10種飼料中香芹酚和百里香酚的添加回收率和相對標準偏差(n=3)

2.6 線性范圍和檢出限

通過選取500、250、50、25 μg/ml和1 μg/ml五個點，考察了此范圍內(nèi)香芹酚和百里香酚的線性。香芹酚和百里香酚的線性方程和R2分別是y=22 848x-123 367，0.994；y=23 913x-148 905，0.993，說明在500 μg/ml到1 μg/ml的范圍內(nèi)，香芹酚和百里香酚的濃度與儀器響應呈良好的線性相關。以儀器噪聲3倍計算，香芹酚和百里香酚的儀器檢出限為0.8 μg/ml；按照實際添加回收率試驗，香芹酚和百里香酚方法定量限為10 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了飼料樣品中香芹酚和百里香酚的氣相色譜檢測方法。樣品采用改良后的QuEChERS前處理方法，先用乙酸乙酯超聲提取，濃縮后經(jīng)PSA、GCB和無水硫酸鈉的凈化，實現(xiàn)了香芹酚和百里香酚的有效提取；方法的定量限達到10 mg/kg。本方法簡單快速，定量限低，可滿足飼料中香芹酚和百里香酚的檢測要求。