■朱雪飛 王金榮 尹艷麗 陳培英 趙銀麗 蘇蘭利

（河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

苜蓿是一種優(yōu)質的豆科牧草，在我國有著2 000多年的種植歷史。到2012年，中國苜蓿的種植面積約為133萬公頃。苜蓿的蛋白質含量很高，青飼料中粗蛋白質含量為15%～25%[1]，氨基酸組成全面均衡，容易被草食家畜轉化利用[2]，是優(yōu)良的蛋白飼料原料，具有“牧草之王”的美稱[3]。近年來，我國的蛋白質飼料原料資源缺乏，開辟新的植物蛋白質資源是解決蛋白質飼料短缺的途徑之一，苜蓿作為一種優(yōu)良的蛋白飼料資源，提高苜蓿蛋白質的利用率對解決蛋白飼料資源短缺具有積極的意義[4]。

雖然苜蓿是一種優(yōu)良的蛋白質資源，但其纖維素含量較高，適口性差，目前多采用微生物發(fā)酵法改善苜蓿草粉的品質，提高蛋白質的產量。微生物發(fā)酵法是一種常用的改善飼料原料品質，提高蛋白質含量的方法。Hong等采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕，結果表明所得的發(fā)酵產品中粗蛋白質的含量有明顯增加，并且胰蛋白酶抑制劑降解率高達84.44%[5]。曲敏等在采用嗜酸乳桿菌發(fā)酵制備苜蓿葉蛋白的研究中得到葉蛋白的提取率為14.90%，葉蛋白中粗蛋白質的含量為45.08%[6]。酵母菌能夠在發(fā)酵過程中分泌大量水解酶類，利用無機氮源和碳水化合物合成微生物蛋白，降解抗營養(yǎng)因子，并產生生物活性物質。利用酵母菌發(fā)酵的豆粕有抗病、強化營養(yǎng)和促進生長的效果[7-8]。本試驗擬采用啤酒酵母進行單因素發(fā)酵試驗，在此基礎上，采用響應面分析法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最終得到最佳的發(fā)酵條件，以期改善苜蓿草粉的品質，降低粗纖維含量，提高苜蓿蛋白質的含量。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

本試驗首先采用單因素試驗，以發(fā)酵后苜蓿粉中的粗蛋白質含量及真蛋白質含量為檢測指標，篩選出最適的料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時間；在單因素試驗的基礎上采用3因素3水平響應面分析法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以發(fā)酵后粗蛋白質含量的增加量為檢測指標，確定出最佳發(fā)酵條件。

1.2 試驗材料

1.2.1 發(fā)酵菌種

試驗所用啤酒酵母菌株來自于河南工業(yè)大學生物工程學院發(fā)酵工程實驗室。

1.2.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加水煮爛，經8層紗布過濾，加入蔗糖，瓊脂，待瓊脂完全溶解后，121℃滅菌25 min。

種子液培養(yǎng)基（PDA液體培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加水煮爛，經8層紗布過濾，加入蔗糖，121℃滅菌25 min。

1.2.3 苜蓿

本試驗所用的紫花苜蓿均采集于河南農業(yè)大學科學實驗基地。將苜蓿自然晾曬干燥后粉碎成草粉備用。

1.2.4 試劑及儀器

試劑：硼酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；鹽酸（洛陽昊華試劑有限公司）；硫酸（洛陽昊華試劑有限公司）；蔗糖（天津市科密歐化學試劑有限公司）；瓊脂粉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；硫酸銅（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；丙酮（天津市科密歐化學試劑有限公司）等。

儀器設備：DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；K9840自動凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；SH220石墨消解儀（濟南海能儀器股份有限公司）；電爐；馬弗爐等。

1.3 試驗方法

1.3.1 啤酒酵母菌種活化及培養(yǎng)

菌種活化：將保存于冰箱中的斜面菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。

種子液制備：將培養(yǎng)24 h的菌種接種于液體菌種培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)14 h。

啤酒酵母生長曲線測定：取適量菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定OD600nm值，以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標繪制啤酒酵母的生長曲線。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗設計

以料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時間為因素進行單因素發(fā)酵試驗，以粗蛋白質和真蛋白質為檢測指標。

采用苜蓿草粉為培養(yǎng)基，調節(jié)初始料水比為：1∶0.8、1∶1.2、1∶1.5和1∶1.8，其它條件不變進行發(fā)酵；分別選擇25、28、31、34 ℃為發(fā)酵溫度，在其它條件不變的情況下進行發(fā)酵；將培養(yǎng)好的種子液按數量級為106、107、108和109cfu/g進行接種，其它條件不變進行發(fā)酵；將發(fā)酵條件分別設定為36、72、108、144 h，在其它條件不變的情況下進行發(fā)酵，發(fā)酵結束后測定粗蛋白質和真蛋白質的含量。根據所測粗蛋白質和真蛋白質含量的高低，確定各個因素的最佳試驗水平。

1.3.2.2 響應面分析

在單因素試驗的基礎上，采用SAS 9.0軟件，根據Box-Benhnken試驗設計原理，選取對于發(fā)酵結果影響較大的料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為因素，設計3因素3水平的響應面分析試驗。建立各因素與粗蛋白質增加量之間的數學模型，通過分析得到最佳發(fā)酵條件。

1.3.3 各指標檢測方法

樣品的制備：發(fā)酵結束后，65℃風干8 h，在空氣中回潮，粉碎，過40目篩。

粗蛋白質根據GB/T6432-1994測定；真蛋白質的檢測是先將蛋白質沉淀，除去非蛋白含氮物質，再用凱氏定氮法測定[9]；粗纖維參照張麗英的濾袋技術在飼料纖維素分析中的應用檢測[10]。

1.3.4 數據處理

在本試驗中，對于單因素試驗的數據采用SAS 9.0軟件，單因素方差分析中的Duncan's multiplerange test多重比較法進行分析。在響應面試驗中，采用SAS 9.0軟件，Box-Benhnken試驗設計原理進行試驗設計，對響應面試驗結果進行多元線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 啤酒酵母生長曲線的測定

以生長時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標繪制啤酒酵母的生長曲線，如圖1所示。啤酒酵母在培養(yǎng)6 h后，OD值快速上升，菌株進入對數期；在15 h到18 h中間，OD值逐漸平穩(wěn)，菌株進入穩(wěn)定期。因為在對數期接種相對較好，所以，選擇在14 h進行接種。

圖1 啤酒酵母的生長曲線

2.2 啤酒酵母發(fā)酵苜蓿工藝參數的優(yōu)化

采用單因素試驗篩選啤酒酵母發(fā)酵苜蓿粉工藝參數，選擇料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時間為試驗變量，以測定粗蛋白質及真蛋白質含量為參考指標，確定各因素在發(fā)酵過程的影響規(guī)律及最佳水平范圍。

2.2.1 料水比對發(fā)酵的影響（見表1）

表1 料水比對發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質及真蛋白質含量的影響（%）

由表1可知，隨著培養(yǎng)基含水量的增加，粗蛋白質和真蛋白質的含量也在逐漸的增加，當料水比為1∶1.5時，粗蛋白質的含量達到26.21%，真蛋白質含量為21.18%，高于其它的試驗組，故選擇合適的料水比為1∶1.5。

2.2.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響（見表2）

表2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質及真蛋白質的影響（%）

通過表2可見，隨著發(fā)酵溫度的增加，粗蛋白質及真蛋白質均在28℃達到最大值26.73%及22.73%。結合發(fā)酵后苜蓿草粉中粗蛋白質及真蛋白質含量的變化可知，當發(fā)酵溫度為28℃時高于其它各組，所以選擇的適宜的發(fā)酵溫度為28℃。

2.2.3 接種量對發(fā)酵的影響（見表3）

表3 接種量對發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質及真蛋白質的影響（%）

由表3可見，隨著接種量的增加，粗蛋白質的含量增加，當接種量為108cfu/g時，粗蛋白質的含量為26.59%，高于其它的接種量組。真蛋白質在接種量為109cfu/g時，達到最大，綜合真蛋白質和粗蛋白質的含量變化，所以，選擇接種量為108cfu/g較為適宜。

2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響（見表4）

表4 發(fā)酵時間對發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質及真蛋白質的影響（%）

由表4可見，隨著發(fā)酵時間的增長，粗蛋白質的含量呈現先增加后降低的趨勢，在108 h最高為26.73%，真蛋白質的含量隨著發(fā)酵時間的增加一直增加。結合粗蛋白質及真蛋白質二者含量的變化可知，選擇較為適宜的發(fā)酵時間為108 h。

2.3 響應面發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 響應面試驗設計及結果分析

根據單因素試驗的結果，選取對發(fā)酵結果影響較大的料水比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為因素，每個因素取3個水平，進行響應面分析設計，進一步優(yōu)化各因素的參數值。各因素水平的編碼表見表5，試驗設計及結果見6。

利用SAS 9.0軟件對表6中的響應面設計試驗結果進行分析，響應面結果分析見表7。回歸模型極顯著(P=0.000 261＜0.01)。并可得到二次多元回歸方程：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32。失擬項P=0.167 237＞0.05不顯著，說明模型適當，回歸方程擬合度良好?；貧w方程的復相關系數為0.988 4，校正系數為0.967 6，表明該模型對粗蛋白質的增加量可以96.76%的解釋。X1，X2，X3的P值均小于0.05，表明料水比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對苜蓿發(fā)酵過程中粗蛋白質含量的變化有顯著的影響，其中發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的影響較大。

表5 試驗設計因素水平及編碼

表6 Box-Benhnken響應面試驗設計及結果

表7 響應面結果方差分析

對回歸方程求一階偏導數，整理方程組得：X1=0.051 3，X2=0.404 8，X3=0.101，將X1、X2、X3代入回歸方程，得到預測粗蛋白質增加量最大值為4.44%，也就是粗蛋白質含量為26.81%。由X1、X2、X3整理得啤酒酵母發(fā)酵苜蓿的最佳條件為料水比1∶1.52，發(fā)酵時間為122.6 h，發(fā)酵溫度為28.3℃。

2.3.2 模型的驗證

為了驗證模型的有效性，對響應面優(yōu)化得到的最佳條件，即料水比1∶1.52，發(fā)酵時間122.6 h，發(fā)酵溫度28.3℃進行試驗，重復3次，測得粗蛋白質的含量為26.65%，與預測值26.81%接近，相對誤差為0.60%?？梢娫撃Ｐ涂梢杂行У靥岣哕俎４值鞍踪|的含量。

對采用最佳條件發(fā)酵的苜蓿草粉進行纖維素的檢測，測得發(fā)酵后的苜蓿粉纖維素含量為15.73%，比未經發(fā)酵的苜蓿纖維素含量19.30%降低了18.50%。這對于苜蓿草粉粗纖維含量高，適口性差，有較好的改善。

3 討論

本試驗通過對啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿的工藝進行研究，建立了關鍵影響苜蓿粗蛋白質增加量的各因素間的二次多項數學模型：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32，確定了啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿的工藝條件。測得經啤酒酵母發(fā)酵后粗蛋白質的含量為26.65%，比未發(fā)酵時粗蛋白質含量提高19.13%，這與劉照娟采用啤酒酵母發(fā)酵苜蓿草粉時粗蛋白質含量相符合[11]。

在進行料水比、發(fā)酵溫度、接種量以及發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響時，料水比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間對于發(fā)酵結果的影響較大。

料水比過高過低，對于蛋白質和真蛋白質的含量均有影響，其主要原因是當培養(yǎng)基的含水量過高，通透性不好，會影響微生物的生長和代謝，影響發(fā)酵結果，進而影響粗蛋白質及真蛋白質的含量；當培養(yǎng)基含水量過低會影響微生物對營養(yǎng)物質的利用，進而影響微生物生長和代謝。這與嚴鶴松的試驗在發(fā)酵過程中料水比過高過低均會影響發(fā)酵豆粕粗蛋白質的含量的結果一致[12]。

不同的微生物都會有其最適的生長溫度，高于或者低于最適溫度，微生物的生長和代謝都會受到影響，從而影響發(fā)酵結果。從吳勝華等采用啤酒酵母單菌發(fā)酵豆粕的研究中可知，高于或低于最適生長溫度對胰蛋白酶抑制因子和小肽的含量均有影響[13]。

隨著接種量的增加，粗蛋白質的含量先增加，到接種量為108cfu/g時，達到最大，稍后，稍微有減少，但效果不是太明顯，這是因為接種量過大導致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質消耗過快，代謝副產物積累，從而影響微生物的生長，影響發(fā)酵結果[14]。

在本試驗中，粗蛋白質的含量增加，是因為微生物的生長要利用吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，隨著營養(yǎng)物質的吸收利用，培養(yǎng)基的相對質量減少，而氮的總量不變，從而使粗蛋白質的含量相對增加。

4 小結

通過本試驗可以得到啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿提高粗蛋白質含量的最優(yōu)條件為：料水比：1∶1.52，發(fā)酵時間為122.6 h，發(fā)酵溫度為28.3℃，粗蛋白質的含量為26.81%；通過驗證試驗，測得粗蛋白質的含量為26.65%，與理論預測值相比，相對誤差為0.60%，發(fā)酵后的苜蓿粉纖維素含量為15.73%，比未經發(fā)酵的苜蓿纖維素含量19.30%降低了18.50%。試驗結果表明該模型能夠使粗蛋白質的含量相對增加，纖維素的含量相對降低，對于改善苜蓿粉品質，提高蛋白質的產量有較好的效果。