盧慶華 邢孟蘭 蔡 祿

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所,內(nèi)蒙古包頭,014010)

?

·混合菌種選育·

降解蘆葦木素復(fù)合菌種的選育

盧慶華 邢孟蘭 蔡 祿

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所,內(nèi)蒙古包頭,014010)

選用普通青霉菌(A)、產(chǎn)黃青霉菌(B)、向病菌(C)和煙曲霉菌(D)作為實驗菌種對蘆葦木素進(jìn)行降解。通過對 4種菌種進(jìn)行不同比例的復(fù)合制成復(fù)合菌,比較木素降解率,從而確定最佳復(fù)合菌。然后進(jìn)行復(fù)合菌種不同復(fù)合方式、不同復(fù)合比例和固液比的優(yōu)化,得到最佳復(fù)合菌。結(jié)果表明,ABD復(fù)合菌木素降解率最高,ABD復(fù)合菌在8天、復(fù)合比例為A：B：D=1：4：16時,木素含量為10.7%,降解率達(dá)67.3%。

復(fù)合菌種；高效降解；木素；菌種選育；蘆葦

我國森林資源匱乏,但擁有豐富的非木材資源——蘆葦。因此,以蘆葦代替木材進(jìn)行制漿造紙,是解決目前木材資源短缺,促進(jìn)造紙行業(yè)發(fā)展的必經(jīng)之路[1]。蘆葦在我國分布廣泛,目前主要集中分布在湖南、湖北、東北、內(nèi)蒙古、新疆等[2]。在內(nèi)蒙古烏梁素海地區(qū),蘆葦面積已達(dá)120 km2,占全湖面積的2/5,產(chǎn)量可達(dá)10萬t,是當(dāng)?shù)卦旒垙S的主要原料基地[3]。但是傳統(tǒng)的物理化學(xué)法制漿存在高能耗、污染嚴(yán)重等缺點,以至于多家造紙廠被關(guān)停,致使蘆葦不能得到利用。由于水體的富營養(yǎng)化使烏梁素海中的蘆葦大量生長繁衍,現(xiàn)已遍及全湖,使得烏梁素海沼澤化程度越來越大；水生生物生存空間縮小,生物多樣性下降[4]。因此采用無污染或少污染的制漿方法,在我國有著特殊的意義[5]。但是要想有效利用木材纖維素原料中的纖維素和半纖維素就必須首先將它們從木素的束縛中解脫出來。利用對木素具有選擇性降解能力的微生物對造紙原料進(jìn)行預(yù)處理成為該類研究的一個方向[6]。

許多研究學(xué)者在篩選得到木素降解菌上做了大量的工作,但以往的工作都集中在菌種的培養(yǎng)、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化以及單菌種降解預(yù)處理木素等工藝的優(yōu)化[7-8]。而木素的降解是微生物共同作用的結(jié)果,所以近幾年研究者多將目光投向了復(fù)合菌種的木素降解上。研究表明復(fù)合菌種比單一菌種對木素的降解效果更好[9-11]。因此本實驗對4種木素降解菌種進(jìn)行了協(xié)同降解蘆葦木素組合方式的探索,并對其降解效應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,通過考察復(fù)合菌對蘆葦木素的降解效率,選育出優(yōu)勢復(fù)合菌,以期為蘆葦?shù)木C合利用提供理論與數(shù)據(jù)參考。

1 實 驗

1.1 實驗材料

實驗菌種：普通青霉菌(A),產(chǎn)黃青霉菌(B),向病菌(C),煙曲霉菌(D)。4種菌都由本實驗室篩選得到,由北京三博生物技術(shù)有限公司鑒定,都具有降解木素的能力。

蘆葦,取自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市的烏梁素海。蘆葦切成2 cm左右待用。經(jīng)測定蘆葦?shù)哪舅睾繛?2.6%,綜纖維素含量為50.5%。

1.2 實驗方法

1.2.1 單菌種降解蘆葦木素

先培養(yǎng)、活化實驗所用4種菌種。將活化好的菌液以培養(yǎng)液5%的接種量接種于PDA培養(yǎng)基中,溫度30℃,轉(zhuǎn)速170 r/min,培養(yǎng)3天后,向裝有300 mL菌液的錐形瓶中加入10 g蘆葦浸泡,之后每2天取樣1次,分別測定酸不溶木素含量,確定最佳菌種。再進(jìn)行蘆葦和菌液量用量比的優(yōu)化,即在10 g蘆葦中分別加入100、150、200、250、300 mL的菌液進(jìn)行優(yōu)化，即固液比為1：10、1：15、1：20、1：25、1：30。酸不溶木素含量的測定按照GB/ T 747—2003進(jìn)行。

1.2.2 2種菌復(fù)合降解蘆葦木素

將A、B、C、D 4種菌采用兩兩菌種復(fù)合方式進(jìn)行復(fù)合,分別為AB、AC、AD、BC、BD、CD。按照以上復(fù)合方式將菌液以1：1的比例接入PDA培養(yǎng)基中放入搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后,分別向每瓶培養(yǎng)基中加入蘆葦10 g,每2天取樣1次,測量酸不溶木素含量,得到最優(yōu)組合后,然后進(jìn)行菌液量和蘆葦加入量比例的優(yōu)化(方法同單菌)。再對降解效果最好的復(fù)合菌種進(jìn)行復(fù)合比例的優(yōu)化,其復(fù)合比(質(zhì)量比)例為2：1、1：2、3：1、1：3、1：4、4：1、1：5、5：1。

1.2.3 3種菌復(fù)合降解蘆葦木素

將A、B、C、D進(jìn)行3種菌復(fù)合,共有4種復(fù)合方式。分別為ABC、ABD、ACD、BCD。培養(yǎng)方法與2種菌復(fù)合的相同。

1.2.4 4種菌復(fù)合降解蘆葦木素

將A、B、C、D 4種菌復(fù)合,只有1種復(fù)合方式,為ABCD。培養(yǎng)方法與2種菌復(fù)合的相同。

2 結(jié)果與分析

在前期的實驗過程中發(fā)現(xiàn),在降解時間超過10天時,木素的含量又增加了,可能是由于木素被破壞以后,釋放出的纖維素也開始被降解,所以木素含量呈先下降后上升的趨勢。而且大于10天的降解時間較長,因此,以下實驗都把降解時間控制在10天以內(nèi),以期得到快速、高效的木素降解菌種。

2.1 單菌種降解蘆葦木素及條件優(yōu)化

圖1為單菌種降解對蘆葦木素含量的影響。由圖1可以看出,B菌降解效果最好,隨著降解時間的延長，木素含量呈下降趨勢,在第10天時,木素的降解率為38.8%。

圖1 單菌種對蘆葦木素含量的影響

由圖1可知,B菌降解蘆葦木素效果最好,在此基礎(chǔ)之上,對B菌降解蘆葦木素的條件進(jìn)行優(yōu)化,圖2為B菌固液比(蘆葦：菌液,以下同)對木素含量的影響。從圖2可知,當(dāng)固液比為1：20時,降解效果最好,在第10天時,降解率為46.5%。

圖2 B菌固液比對蘆葦木素含量的影響

2.2 2種菌復(fù)合降解蘆葦木素及條件優(yōu)化

圖3為2種菌復(fù)合降解對蘆葦木素含量的影響。由圖3可知,2種菌復(fù)合降解蘆葦木素時,木素含量隨著降解時間的增加都有所降低,在第4天時,BC、AD和BD復(fù)合菌使木素含量都有大幅度降低,而之后BC、AD復(fù)合菌木素含量有所增加,BD復(fù)合菌一直呈下降趨勢,且在第10天時,木素降解效果最好,木素降解率為51.7%。由此得出,BD復(fù)合菌降解蘆葦木素效果最好。

圖3 2種菌復(fù)合降解對蘆葦木素含量的影響

圖4 BD復(fù)合菌固液比對蘆葦木素含量的影響

圖4為BD復(fù)合菌固液比對蘆葦木素含量的影響。由圖4可以得出,當(dāng)固液比為1：20時,木素降解效果最好。這是因為當(dāng)固液比為1：20時,菌液正好完全浸泡蘆葦,可以使真菌在好氧的條件下,很好地生長,固液比較大時,通氧狀態(tài)不好,影響菌種生長,不能很好地降解蘆葦,固液比小于1：20時,菌液不能完全浸泡蘆葦,蘆葦木素降解不全面。

表2 不同復(fù)合比的BD復(fù)合菌對蘆葦木素降解的影響 %

表3 不同復(fù)合比的A：BD復(fù)合菌對蘆葦木素降解的影響 %

BD復(fù)合菌不同比例對蘆葦木素降解的影響見表2。由表2可知,當(dāng)B：D=1：4時,木素降解效果最好,在第10天時，木素含量為12.0%,木素降解率為63.2%。綜合圖1可以得出，復(fù)合培養(yǎng)BD降解木素情況明顯高于單菌培養(yǎng)降解木素,從單一菌來看,B菌降解效果優(yōu)于D菌降解,達(dá)到相同效果時,復(fù)合菌比單一菌種降解速率快,由此說明兩種菌之間具有協(xié)同降解作用。

2.3 3種菌復(fù)合降解蘆葦木素及條件優(yōu)化

圖5為3種復(fù)合菌降解對蘆葦木素含量的影響。由圖5可以看出,3種菌組合降解蘆葦木素時,木素含量隨著降解時間的增加都有所降低,且在第8天時,所有復(fù)合菌均使木素含量大幅度降低,且一直呈下降趨勢,其中ABD復(fù)合菌降解效果最好,在第10天時,木素含量為13.8%，木素降解率為57.6%。

圖5 3種菌復(fù)合降解對蘆葦木素含量的影響

圖6 ABD復(fù)合菌固液比對蘆葦木素含量的影響

圖6為ABD復(fù)合菌固液比對蘆葦木素含量的影響。由圖6 可知,當(dāng)ABD復(fù)合菌固液比為1：20時,木素降解效果最好,在第8天降解效果最好，木素降解率遠(yuǎn)大于其他固液比,而且在降解時間上也提前了2天。

在2種菌最優(yōu)條件下,即在BD菌復(fù)合比1：4的基礎(chǔ)之上,對3種菌進(jìn)行復(fù)合比優(yōu)化,ABD菌種在第8天、A：B：D復(fù)合比為1：4：16時,降解效果最好,木素降解率為67.3%,結(jié)果如表3所示。經(jīng)過綜纖維素含量的測定(方法見GB/T2677.10—1995),纖維素的降解率小于15%。綜合整個實驗來看,A菌、B菌和D菌之間都存在著互惠性,表現(xiàn)出很強的木素降解能力。

2.4 4種菌復(fù)合降解蘆葦木素

在A：B：D：C=1：4：16：1的條件下，進(jìn)行4種菌復(fù)合降解對蘆葦木素含量的影響，結(jié)果見圖7。從圖7可知，木素含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,在第10天時,降解效果最好,木素含量為19.3%,降解率為40.9%。4種菌復(fù)合培養(yǎng)降解蘆葦木素效果小于3種菌和2種菌的效果,說明C菌對ABD菌種生長起抑制作用。

圖7 4種菌復(fù)合降解對蘆葦木素含量的影響

3 結(jié) 論

以蘆葦為原料,從土壤中篩選得到的有木素降解能力的普通青霉菌(A)、產(chǎn)黃青霉菌(B)、向病菌(C)、煙曲霉(D)4種菌種為實驗菌種,通過4種菌種不同復(fù)合對蘆葦木素進(jìn)行降解。實驗結(jié)果表明,3種復(fù)合中，ABD復(fù)合對蘆葦木素降解率最好,ABD復(fù)合菌在降解時間8天、復(fù)合比為A：B：D=1：4：16時,木素含量為10.7%,降解率達(dá)到67.3%,而制漿所需的纖維素的降解較少。

[1] Li Jinhua,Song Hongzhu,Xue Yongchang,et al.Present Situations and Development Strategy on Raw Material of Wood Fiber for Pulp and Paper Industry in China[J].World Forestry Research,2003,16(6):32.

李金花,宋紅竹,薛永常,等.我國制漿造紙木材纖維原料的現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J].世界林業(yè)研究,2003,16(6)：32.

[2] ZHAN Huai-yu.Supply and Utilization of Non-wood Fibers and Waste Papers in China Paper Industry[J].China Pulp & Paper,2010,29(8)：56.

詹懷宇.我國造紙用非木材纖維和廢紙原料供應(yīng)與利用[J].中國造紙,2010,29(8)：56.

[3] DUAN Xiao-nan,WANG Xiao-ke,GUO Yu-hua,et al.Effects of Environmental Factors on Evolution of Reed Community in Wuliangsu Lake,Inner Mongolia[J].Journal of Arid Land Resources and Environment,2006,20(7):175.

段曉男,王效科,郭玉華,等.烏梁素海蘆葦資源演變及影響因素分析[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2006,20(7):175.

[4] 趙 軍.烏梁素海蘆葦資源的生產(chǎn)現(xiàn)狀與展望[J].內(nèi)蒙古草業(yè),2001(2):47.

[5] 余惠生,付時雨,秦文娟.生物技術(shù)在制漿造紙工業(yè)的應(yīng)用及其最新進(jìn)展[J].廣東造紙,1999(5/6):30.

[6] AniwarApiz1,Fu Shiyu,Zhan Huaiyu.Study on Biochemical Pulping and Bleaching of Reed[J].Transactions of China Pulp and Paper,2003,18(2):51.

艾尼瓦爾,付時雨,詹懷宇.蘆葦?shù)纳锘瘜W(xué)制漿及漂白研究[J].中國造紙學(xué)報， 2003,18(2):51.

[7] Hofrichter M.Review:lignin conversion by manganese peroxidase (MnP)[J].Enzyme and Microbial Technology,2002,30(4):454.

[8] Hatvani N,Mécsa I.Effect of the nutrient composition on dye decolorisation and extracellular enzyme production by Lentinus edodes on solid medium[J].Enzyme and Microbial Technology,2002,30(3):381.

[9] ZHANG Ming-xu,WANG Long-gui,OU Ze-sheng,et al.Selection of several degration lignin funguns and the experimental study of their coopporation to diodegradation of coal[J].Joural of China Coal Society,2007,32(2):634.

張明旭,王龍貴,歐澤深,等.幾種木質(zhì)素降解菌的篩選及其協(xié)同作用降解煤炭的研究[J].煤炭學(xué)報,2007,32(2):634.

[10] CHEN Yao-ning,ZENG Guang-ming,YU Man,et al.Screening of compatible strains with phanerochaete chrysosporium for biodegradation of straw[J].China Environmental Science,2007,27(2):189.

陳耀寧,曾光明,喻 曼,等.與黃孢原毛平革菌協(xié)同降解稻草的混合菌篩選[J].中國環(huán)境科學(xué),2007,27(2):189.

(責(zé)任編輯：董鳳霞)

Screening of Mixed Strains for Synergistic Degradation of Reed Lignin

LU Qing-hua*XING Meng-lan CAI Lu

(TheInstituteofBioengineeringandTechnologyInnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology,Baotou,InnerMongoliaAutonomousRegion,014010)(*E-mail:luqh106@hotmail.com)

The mixed strains used for degradation of lignin in reed were screened.Penicillium common A,Penicillium chrysogenum B,bacteria C and Aspergillus fumigates D.were utilized as experimental strains.By using different combination of the four strains to degrade the lignin and the degradation rates of lignin were compared,so as to determine the optimum strain combination.Then different mixing methods of mixed strains,various mixing ratios and solid-to-liquid ratios were optimized to obtain the optimal strains combination.The results showed that the ABD combination showed the best lignin degradation rate.The lignin content was 10.7% and the degradation rate was 67.3% when the mixing ratio of A：B：D was 1：4：16 and after eight days’ treatment.

mixed bacteria; efficient degradation; lignin; bacteria screening; reed

盧慶華女士,講師；研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

2014-08-30(修改稿)

TS 744

A

0254-508X(2015)02-0073-04