蔣桔蓮 陳健 鐘倩怡 金媛媛 王美林 陳琪 盧洪勝

宮頸癌及癌前病變患者HPV感染與機體免疫狀態(tài)的研究

蔣桔蓮 陳健 鐘倩怡 金媛媛 王美林 陳琪 盧洪勝

目的鉬探討宮頸癌及癌前病變患者HPV感染及全身細胞免疫功能狀態(tài)。方法鉬選擇2014年8月至2015年1月婦產(chǎn)科門診就診的宮頸癌及癌前病變患者271例，進行液基細胞學(xué)（TCT）、HPV-DNA和陰道鏡下病理檢查，同時行流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群。 結(jié)果 宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級（CINⅡ）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級（CINⅢ）及宮頸鱗狀細胞癌（SCC）患者隨著宮頸病變程度的加重，HPV陽性率明顯升高（P＜0.05）；隨著病理分期的進展，HPV陽性率也明顯升高（P＜0.01）。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及SCC組CD3+T細胞比例與宮頸炎組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），CD4+T細胞比例逐漸下降，且SCC組與宮頸炎組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而CD8+T細胞比例有逐漸增加的趨勢，且CINⅡ、CINⅢ、SCC組與宮頸炎組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。SCC及CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組CD19+B細胞比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），而NK細胞比例的差異與宮頸炎組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且隨著病理分期進展逐漸遞增。 結(jié)論 宮頸病變患者體內(nèi)存在明顯的淋巴細胞亞群偏移,可能與HPV病毒逃避免疫監(jiān)視有關(guān)，了解這一變化可為免疫治療干預(yù)癌前病變提供幫助。

液基細胞學(xué) HPV-DNA 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 宮頸癌 淋巴細胞亞群

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計，全球女性每年有新發(fā)宮頸癌病例約50萬[1-2]，在我國每年有14萬新發(fā)病例[3]，并且患者呈日益年輕化的趨勢，對婦女的生命及生活質(zhì)量造成了很大的威脅。目前認為，宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染引起的一種較常見的婦科疾病。HPV是一種無包膜的小型DNA病毒，研究提示HPV的清除失敗與機體的細胞免疫功能異常有關(guān)[4]。本研究通過對不同級別宮頸病變患者進行HPV感染情況調(diào)查及外周血淋巴細胞亞群檢測，來探討宮頸病變患者的全身免疫功能變化，為宮頸癌的免疫治療提供臨床基礎(chǔ)資料。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年8月至2015年1月臨海市婦幼保健院和臺州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診患者中，有宮頸糜爛、肥大、接觸性出血、潰瘍及乳頭樣增生等病變患者，進行液基細胞學(xué)（TCT）、HPV-DNA和陰道鏡下病理活檢3種方法檢查。入選患者共271例，年齡21～68歲，平均（35.6±8.2）歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 CD3+-FITC/CD8+-PE/CD45+-PerCP/CD4+-APCCD3+-FITC /CD16+-PECD56+-PE/ CD45+-PerCP/CD19+-APC、同型對照及BD FACS Calibur配套試劑，均購自美國BD公司，檢測儀器為BD FACS Calibur流式細胞儀。

1.2.2 TCT檢查 用宮頸毛刷取宮頸外口和頸管的脫落細胞，將采集的細胞洗入盛有Thinprep 2000系統(tǒng)處理后，計算機程序控制自動完成，形成直徑2 cm薄層均勻的圖片，固定、染色、鏡檢。診斷標準采用2001年TBS診斷標準[3]，包括炎癥細胞改變、意義不明的非典型鱗狀細胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）及鱗狀細胞癌（SCC）。

1.2.3 HC2-HPV-DNA檢測 采用美國Digene公司提供的第2代雜交捕獲技術(shù)，可檢測HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68型13種高危型 HPV亞型。

1.2.4 宮頸組織病理活檢 醫(yī)生在陰道鏡下行可疑部位多點活檢或?qū)m頸管搔刮術(shù)，標本送病理科檢查，按2003年WHO子宮頸腫瘤組織學(xué)分類標準進行病理診斷和分期，包括慢性炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級（CINⅡ）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級（CINⅢ）、鱗狀細胞癌（SCC）。

1.2.5 淋巴細胞亞群檢測 所有觀察對象均于清晨空腹抽取靜脈血2～4ml,乙二胺四乙酸鉀鹽（EDTA-K2）抗凝。檢測時吸取100～500μl靜脈血加2～5ml不含固定劑的紅細胞裂解液，分離有核細胞，用磷酸鹽緩沖液制成細胞濃度為1×107/ml的單細胞懸液備用。按多色分析法進行染色，染色前按100μl/106細胞的比例加AB型血漿，4℃培養(yǎng)20min以阻斷可結(jié)晶片段(Fc)受體。分別取EDTA-K2抗凝全血100μl加入3個試管，各自分別加入20μl同型對照、CD3+/CD8+/CD45+/CD4+、CD3+/ CD16+CD56+/CD45+/CD19+，室溫下避光孵育20min，加入紅細胞裂解液1ml，室溫避光放置15～20 min，振蕩混勻，1 500r/min離心5min，棄上清液,用2ml PBS洗滌1次，加入400μlPBS重新浮懸細胞，上流式細胞儀檢測。使用BDFACSCalibur流式細胞儀配套的cellquest軟件獲取并分析10 000個細胞，同時設(shè)陰陽對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用方差分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同TCT檢查結(jié)果患者HPV陽性率的比較 見表1。

表1 不同TCT檢查結(jié)果患者HPV陽性率的比較[例（%）]

由表1可見，隨著宮頸病變程度的加重，HPV陽性率明顯升高（χ2=9.69，P＜0.05）。

2.2 不同病理分期患者HPV陽性率的比較 見表2。

表2 不同病理分期患者HPV陽性率的比較[例（%）]

由表2可見，隨著病理分期的進展，HPV陽性率明顯升高（χ2=20.96，P＜0.01）。

2.3 不同病理分期患者淋巴細胞亞群的表達 見表3。

表3 不同病理分期宮頸病變患者淋巴細胞亞群表達水平比較

由表3可見，不同病理分期宮頸病變患者CD3+比例與宮頸炎組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而隨著宮頸病變病理級別的增高，患者的CD4+T細胞比例逐漸下降，SCC組與宮頸炎組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；相反，CD8+T細胞比例有逐漸增加的趨勢，且CINⅡ、CINⅢ、SCC組與宮頸炎組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。CD19+B細胞的表達在各組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及SCC組NK細胞的表達與宮頸炎組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且隨著病理分期的進展逐漸遞增。SCC組與宮頸炎組外周血淋巴細胞流式細胞儀檢測結(jié)果的比較見圖1。

圖1 SCC組與宮頸炎組外周血淋巴細胞流式細胞儀檢測散點圖（A1：宮頸炎組淋巴細胞；A2：宮頸炎組CD3+CD4+；A3：宮頸炎組CD3+CD8+；A4：宮頸炎組B淋巴細胞、NK細胞；B1：SCC組淋巴細胞；B2：SCC組CD3+CD4+；B3：SCC組CD3+CD8+；B4：SCC組B淋巴細胞、NK細胞）

由圖1可見，宮頸炎組與SCC組淋巴細胞比例無差異，宮頸炎組CD3+CD4+細胞比例高于SCC組，宮頸炎組CD3+CD8+細胞比例低于SCC組，宮頸炎組B淋巴細胞、NK細胞比例低于SCC組。

3 討論

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ最后發(fā)展到SCC是一個連續(xù)漫長的過程，持續(xù)的高危型HPV感染是其發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)病

因[5-6]。

HPV是一種無包膜的小型DNA病毒，主要編碼兩類蛋白，即早期蛋白（E）和晚期蛋白（L），它具有很強的免疫逃逸能力[7]。從免疫學(xué)的觀點看，在HPV與人體免疫系統(tǒng)的對抗中，主要是病毒自身的或誘導(dǎo)的免疫逃逸機制和人體的免疫應(yīng)答機制之間的平衡來決定病變的轉(zhuǎn)歸。淋巴細胞是構(gòu)成機體免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，而T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機體抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要作用。由于NK細胞具有部分T細胞分化抗原，活化NK細胞可產(chǎn)生IFN-γ，因此一般認為NK細胞與T細胞在發(fā)育上關(guān)系非常密切[8]。淋巴細胞亞群分析是檢測體液免疫功能和細胞免疫功能的重要方法，可以反映機體當前的免疫功能狀態(tài)和平衡水平。HPV和異型增生細胞的清除與否，與宮頸局部的免疫微環(huán)境內(nèi)的平衡息息相關(guān)，干預(yù)失衡狀態(tài)并使其向促進免疫反應(yīng)的方向發(fā)展，應(yīng)該有助于HPV的清除和CIN的消退。細胞毒性T細胞（CTLs）是Thl免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)成分，能夠清除被病原微生物感染的細胞，人體清除被HPV感染的細胞可能主要是依靠細胞毒性作用完成[9]。

我們對宮頸病變患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+等淋巴細胞亞群與分期的關(guān)系進行了研究，研究結(jié)果顯示，不同病理分期宮頸病變患者CD3+比例與宮頸炎組無統(tǒng)計學(xué)差異；CD4+T細胞比例隨著宮頸病變病理級別的增加而逐漸下降，相反，CD8+T細胞比例逐漸升高；CD19+B細胞比例各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異，而不同病理分期宮頸病變患者NK細胞比例與宮頸炎組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，并隨著病理及臨床分期進展而逐漸遞增。本研究的幾項統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，隨著宮頸細胞學(xué)及組織學(xué)檢查結(jié)果嚴重程度的升級，宮頸HPV感染的檢出率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，宮頸癌前期病變及宮頸癌是以HPV感染為核心，以LSIL及HSIL病變構(gòu)成的生物學(xué)譜系為特征的一組連續(xù)性病變[10]?；颊唧w內(nèi)存在明顯的淋巴細胞亞群偏移，這可能是病毒發(fā)生免疫逃逸，由此避免免疫監(jiān)視，而引起宮頸上皮細胞病變發(fā)生、發(fā)展的一種機制。因此，了解宮頸病變患者全身免疫功能的變化，可對其免疫治療提供幫助。

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HPV infection and immune status in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia

JIANG Julian,CHEN Jian,ZHONG Qianyi,et al.Department of Gynecology and Obstetrics,Linhai Women's and Children's Hospital,Linhai 317000,China

【 Abstract】 Objective To investigate HPV infection and immune status in squamous cervical carcinoma(SCC)and cervical intraepithelial neoplasia(CIN). Methods Two hundred and seventy one patients with cervical lesions visiting outpatient department from August 2014 to January 2015 were included in the study.TCT,HPV-DNA tests and colposcopic cervical biopsies were performed,and peripheral blood lymphocyte subsets were examined with flow cytometry in all patients. Results In patients with chronic cervicitis,CINⅠ,CINⅡ,CINⅢand SCC the positives of HPVexpression were increased with the progress of cervical diseases(P＜0.05).And with the progress of the pathological staging,the positive rates of HPV were increased(P＜0.01).There was no significant difference in CD3+T-lymphocytes among chronic cervicitis,CIN and SCC(all P＞0.05).CD4+T-lymphocytes were decreased with the progress of cervical diseases(P＜0.05),while CD8+T-lymphocytes were increased(allP＜0.05).There was no significant difference in CD19+B-lymphocytes(all P＞0.05),while significant difference in NK cells among different cervical diseases(all P＜0.05),the degree of positivity was correlated with clinicopathological stages. Conclusion HPVinfection rate is increased with the progress of cervical lesions,which is associated with the decreased immune status of patients.

TCT HPV-DNA Cervical intraepithelial neoplasia Cervical carcinoma Lymphocyte subsets

2015-05-11）

（本文編輯：沈叔洪）

317000 臨海市婦幼保健院婦產(chǎn)科（蔣桔蓮、金媛媛、王美林，蔣桔蓮現(xiàn)在臺州市立醫(yī)院產(chǎn)科工作）；臺州醫(yī)院恩澤婦產(chǎn)醫(yī)院婦產(chǎn)科（陳?。?；臺州市中心醫(yī)院檢驗科（鐘倩怡、陳琪），病理科（盧洪勝）