陳弦 陶凡 黃麗霞 范皓

孕早、晚期接受七氟醚麻醉對(duì)大鼠子代大腦神經(jīng)發(fā)育的影響

陳弦 陶凡 黃麗霞 范皓

目的鉬研究孕早、晚期Wistar大鼠母體接受七氟醚吸入麻醉對(duì)子代大腦神經(jīng)發(fā)育的影響。方法鉬將12只孕鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為孕6d用藥組（A組）、孕19d用藥組（B組）和對(duì)照組（C組），每組各4只。A、B組分別于孕6d、孕19d時(shí)吸入2.4%七氟醚6h，C組飼養(yǎng)于空氣條件下。應(yīng)用Nissl染色法觀察仔鼠在出生后第1、14、21天腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏體的表達(dá)情況。在仔鼠出生后第32天采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)各組仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 出生后第1天，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度明顯高于A組及C組仔鼠；出生后第14天，B組仔鼠神經(jīng)損傷減輕，A組仔鼠神經(jīng)損傷加重；出生后第21天，B組仔鼠神經(jīng)損傷程度較輕，A組仔鼠神經(jīng)損傷較重。出生后第32天，A組和B組仔鼠逃避潛伏期、穿越目標(biāo)象限次數(shù)、穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組仔鼠相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。 結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)條件下，孕早、晚期母體接受2.4%七氟醚麻醉對(duì)Wistar大鼠子代大腦神經(jīng)發(fā)育的影響隨時(shí)間變化而改變，并不造成子代遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能異常。

七氟醚 子代 學(xué)習(xí)記憶 尼氏體 孕早期 孕晚期 大鼠

七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，誘導(dǎo)迅速，刺激性小，對(duì)循環(huán)抑制輕。隨著產(chǎn)科微創(chuàng)手術(shù)的廣泛開展，越來越多的孕產(chǎn)婦需要使用麻醉藥，甚至在某些緊急情況下需要接受全身麻醉。目前，七氟醚對(duì)孕期胎兒是否安全尚無定論。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)孕早期、孕晚期母體接受七氟醚麻醉后對(duì)子代大腦神經(jīng)發(fā)育及遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響，為臨床麻醉提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制備與分組 成年性成熟未交配雌性Wistar大鼠（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供）24只，體重180～210g。成年性成熟雄性Wistar大鼠（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供）24只，體重300g。雌鼠與雄鼠1∶1合籠飼養(yǎng)。應(yīng)用托盤陰栓檢查法于次日早晨觀察托盤中是否有陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天記為受孕第0日。排除不孕及假孕雌鼠，將12只懷孕雌鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，孕6d用藥組（A組）、孕19d用藥組（B組）以及對(duì)照組（C組），每組各4只。A、B組分別在孕鼠懷孕第6、19天給予七氟醚吸入，濃度2.4%，時(shí)間6h，氧流量0.5L/min。C組一直飼養(yǎng)于空氣條件下。

1.2 自制麻醉箱 將A、B組孕鼠分別于孕6d及孕19d放入20cm×12cm×10cm自制小盒內(nèi)，在盒的兩側(cè)各有一小孔，一端接小動(dòng)物麻醉機(jī)（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供），輸入100%氧氣和七氟醚氣體。另一端為出氣端，接廢氣吸收罐以吸收CO2等。氧流量0.5L/min，七氟醚吸入濃度2.4%，持續(xù)時(shí)間6h。后將孕鼠置于空氣條件下自然蘇醒。

1.3 組織切片制備 孕鼠自然分娩，A組、B組和C組仔鼠中分別取出生后第1、14、21天仔鼠各6只，斷頭取腦，固定于10%中性甲醛溶液中72h。切取包含海馬部位的腦組織塊，進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片，片厚約4μm。

1.4 Nissl染色 組織切片脫蠟至水，加1%甲苯胺藍(lán)水溶液后浸染25min，95%乙醇快速分色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 分別從A、B、C組仔鼠中再選取7只、8只、7只，待長(zhǎng)大至第32天行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮由一個(gè)直徑120cm、高50cm的圓形水池構(gòu)成，水池內(nèi)壁為黑色，水池劃分為4個(gè)象限，每個(gè)象限設(shè)置入水點(diǎn)標(biāo)記，于第4象限內(nèi)放置直徑12cm，高29cm的透明平臺(tái)，槽內(nèi)水深30cm，使平臺(tái)沒于水下1cm，水溫控制在23～25℃，水池上方安裝自動(dòng)攝像系統(tǒng)。參照文獻(xiàn)[1]，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)5d以及空間探索實(shí)驗(yàn)1d。將平臺(tái)所在象限定為目標(biāo)象限。在5d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組仔鼠每日在規(guī)定時(shí)間內(nèi)訓(xùn)練3次，每次間隔1h。將仔鼠分別從除目標(biāo)象限以外的其余3個(gè)象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，第1次入水選擇離目標(biāo)象限最遠(yuǎn)的象限，第2、3次入水選擇目標(biāo)象限毗鄰象限入水。記錄120s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），并讓仔鼠在平臺(tái)上停留10s，超過120s未能找到平臺(tái)者，將其輕柔引導(dǎo)上平臺(tái)并停留在臺(tái)上10s，將其尋找平臺(tái)的時(shí)間定為120s，取每天第1次訓(xùn)練的結(jié)果為當(dāng)天的逃避潛伏期；在第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)，將仔鼠從最遠(yuǎn)象限面向池壁放入水中，計(jì)數(shù)仔鼠在1min內(nèi)穿越平臺(tái)原址的次數(shù)及穿越目標(biāo)象限的次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以示，組間比較用單因素方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組仔鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化出生后第1天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，有神經(jīng)元缺失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)目減少或消失，A組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列稍顯松散，細(xì)胞略腫脹，細(xì)胞質(zhì)著色稍淺，尼氏體數(shù)目略有減少，詳見圖1。出生后第14天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞質(zhì)著色深，尼氏體數(shù)目大致正常；A組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞腫脹，染色較淺，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)目減少，詳見圖2。出生后第21天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列尚整齊，細(xì)胞層數(shù)偏少，細(xì)胞未見明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)著色稍淺，尼氏體數(shù)目大致正常；A組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較稀疏，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)著色淺，尼氏體數(shù)目減少，詳見圖3。

2.2 3組仔鼠逃避潛伏期比較 在定位航行試驗(yàn)中，3組仔鼠在逃避潛伏期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表1。

表1 3組仔鼠逃避潛伏期比較（s）

2.3 3組仔鼠穿越目標(biāo)象限和平臺(tái)次數(shù)比較 在空間探索試驗(yàn)中，3組仔鼠穿越目標(biāo)象限及平臺(tái)次數(shù)的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表2。

表2 3組仔鼠穿越目標(biāo)象限和平臺(tái)次數(shù)比較

3 討論

七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑。研究表明所有吸入麻醉藥均可通過胎盤作用于胎兒，若濃度大，血藥濃度高，則會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生抑制作用[2]。本研究選擇濃度為2.4%（=1MAC）[3]七氟醚吸入6h作用于孕鼠，觀察此麻醉濃度是否會(huì)對(duì)仔鼠造成認(rèn)知功能的影響。

光鏡下尼氏體為嗜堿性斑塊或細(xì)顆粒，均勻分布于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中。若尼氏體大而數(shù)量多，說明神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，相反，在神經(jīng)元受到損傷時(shí)，尼氏體從核周開始崩解為細(xì)塵狀顆粒，進(jìn)而溶解消失，光鏡下表現(xiàn)為尼氏體數(shù)量會(huì)減少甚至消失。在本實(shí)驗(yàn)中，在出生后第1天，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度明顯高于A組及C組仔鼠；出生后第14天，B組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度較前減輕，A組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)損傷逐漸加重趨勢(shì)；出生后第21天，與C組仔鼠相比，A組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元仍然呈現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷表現(xiàn)，B組仔鼠損傷程度較輕。該結(jié)果提示，孕晚期吸入七氟醚所導(dǎo)致的子代神經(jīng)損傷可能具有“可逆性”，孕早期吸入七氟醚對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育可能具有“延遲損傷效應(yīng)”。

圖1 出生后第1天各組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

圖2 出生后第14天各組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

圖3 出生后第21天各組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)與海馬功能相關(guān)的空間參考記憶的主要行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法之一。Wistar大鼠32天齡相當(dāng)于人類8歲，為學(xué)齡期的起始段，本實(shí)驗(yàn)選擇在這個(gè)時(shí)間段進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)定。定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期可以反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲取空間信息的能力。隨著每天訓(xùn)練次數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的瞬時(shí)記憶得到強(qiáng)化，為更準(zhǔn)確地反映其學(xué)習(xí)記憶能力，排除瞬時(shí)記憶對(duì)結(jié)果的干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇每天的第1次數(shù)據(jù)結(jié)果作為對(duì)其前1天學(xué)習(xí)內(nèi)容的記憶能力考評(píng)依據(jù)[1]?？臻g探索實(shí)驗(yàn)反映了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)反復(fù)訓(xùn)練所獲取信息的儲(chǔ)存和再現(xiàn)能力。本實(shí)驗(yàn)中，在第1天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，3組仔鼠首次入水后的逃避潛伏期無明顯差異；在第2、3、4、5天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，與C組仔鼠相比，A、B組仔鼠的逃避潛伏期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明3組仔鼠對(duì)前1天學(xué)習(xí)內(nèi)容的記憶能力無明顯差異。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，3組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及穿越目標(biāo)象限次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明孕早、晚期孕鼠吸入2.4%七氟醚6h并不會(huì)導(dǎo)致子代在學(xué)習(xí)記憶能力等行為學(xué)表現(xiàn)上出現(xiàn)明顯差異。

目前關(guān)于七氟醚對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響褒貶不一。有研究認(rèn)為七氟醚對(duì)缺血缺氧性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，另有研究認(rèn)為七氟醚不會(huì)對(duì)大腦神經(jīng)元發(fā)育造成影響[6]，亦有研究認(rèn)為七氟醚會(huì)對(duì)發(fā)育期大腦神經(jīng)元產(chǎn)生毒性影響[7-11]，其中部分學(xué)者認(rèn)為這種有害影響僅短期存在，不會(huì)持續(xù)至遠(yuǎn)期[9-11]，但亦有學(xué)者認(rèn)為這會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組仔鼠在出生后32d行水迷宮實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力方面的差異，這與李夢(mèng)圓等[12]的研究結(jié)果相符。結(jié)合各組仔鼠在出生后不同階段海馬CA1區(qū)尼氏體染色結(jié)果，考慮可能是神經(jīng)損傷已經(jīng)修復(fù)，也可能是神經(jīng)損傷程度較輕并不至于引起行為學(xué)上異常表現(xiàn)。

綜上所述，孕早期及孕晚期Wistar大鼠母體接受2.4%七氟醚麻醉對(duì)子代大腦神經(jīng)發(fā)育的影響隨時(shí)間變化呈動(dòng)態(tài)改變，并不造成子代遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶功能異常。其原因也許是七氟醚對(duì)大腦發(fā)育影響僅為一過性，或是該影響不足以產(chǎn)生行為學(xué)上的學(xué)習(xí)記憶能力異常，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究以證實(shí)。

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Effect of sevoflurane inhalation anesthesia during early and late pregnancy on offspring brain neural development in rats

CHEN Xian，TAO Fan，HUANG Lixia，et al.Department of Anesthesiology,Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou 310003,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of sevoflurane inhalation anesthesia during early and late pregnancy on offspring brain neural development in rats. Methods Twelve pregnant Wistar rats were randomly divided into group A(6-day gestation),group B(19-day gestation)and group C(control group)with 4 animals in each group.The rats in groups A and B received 2.4%sevoflurane(0.5L/min)oxygen for 6 h at 6th and 19th day of pregnancy,respectively,while those in control group had no any treatment.The expression of Nissl body in the CA1 region of hippocampus of the offspring at postnatal d1,d14 and d21 were observed with Nissl staining technique.The learning and memory function of the offspring was tested by Morris water maze test at postnatal d32. Results At postnatal d1,the injury in the CA1 region of hippocampus of the offspring in group B was more serious than that in group A and C.At postnatal d14,the neural injury of the offspring in group B was alleviated,but that in group A was worse.At postnatal d 21,the neural injury of the offspring in group B was mild,but that in group A was serious. There were no significant differences in escape latency,explore number in the target quadrant and platform of among the offspring of groups A,B and C(P＞0.05). Conclusion The effect of sevoflurane inhalation during early and late pregnancy on offspring brain neural development is time-dependent,but has no significant effect on the learning and memory function.

Sevoflurane Offspring Learning and memory Nissl body Early pregnancy Late pregnancy Rats

2015-01-28）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A044）

310003 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院麻醉科

陶凡，E-mail：461226058@qq.com