張 韻，吳 暉，侯惠嬋

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣州510641;2.廣州市黃埔區(qū)食品藥品檢驗所，廣州510700;3.廣州市藥品檢驗所，廣州510160)

慢性咽炎合劑是廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)院制劑，在臨床使用多年。方由咸竹峰、連翹、木蝴蝶、板藍根、崗梅根、荊芥、柴胡、白花蛇舌草、桔梗、甘草等組成，具有疏風驅邪，解毒利咽之功，治療慢性咽炎療效滿意。方中君藥連翹的有效成分為連翹苷，藥理研究［1］表明，連翹苷具有抗菌、抗病毒、強心、抑制毛細血管通透性的作用，《中國藥典》［2］將其作為連翹的質量控制指標之一，本實驗采用連翹苷作為該制劑的含量測定指標。為保證各批次產品質量的穩(wěn)定性，確保療效，建立了慢性咽炎合劑的質量控制指標，方法可行，操作簡便，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

慢性咽炎合劑(批號 130614，130620，130925，131010，131011)由廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，磷酸(色譜純)，冰醋酸(色譜純)，中性氧化鋁(100-200目，分析純)，薄層預制板(批號20130806，青島海洋化工廠)，展開劑所用試劑均為分析純。連翹苷對照品(110821-200711)，連翹對照藥材1 g(120908-200512)，白花蛇舌草對照藥材 1 g(121183-200402)，柴胡皂苷 a對照品(110777-200507)，柴胡對照藥材 1 g(120992-200504)，荊芥對照藥材1 g(0911-9806)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。高效液相色譜儀:Waters 2695泵，檢測器UV-Waters 2996，百萬分之一電子分析天平(梅特勒XP26)。

2 方法與結果

2.1 連翹薄層色譜鑒別 取本品20 mL，水浴蒸干，加中性氧化鋁1 g拌勻后加置中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內徑1.5 cm)上，用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液;取連翹苷對照品，用乙醇配成0.5 mg/mL溶液，作為對照品溶液;取連翹對照藥材1 g，乙醇20 mL加熱回流30 min，濾液蒸干，與供試品溶液同法操作，作為對照藥材溶液;取缺連翹陰性制劑20 mL，與供試品同法操作，作為陰性對照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰，分別置日光和紫外燈365 nm下檢測，結果見圖1。

2.2 白花蛇舌草薄層色譜鑒別 取本品20 mL，蒸干，殘渣加甲醇10 mL溶解，過濾，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液;取白花蛇舌草對照藥材1 g，加水煎煮(50，30 mL)每次1 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，濾過，作為對照藥材溶液;取缺白花蛇舌草的陰性制劑20 mL，與供試品同法操作，作為陰性對照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以正丁醇-濃氨-乙醇(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰，結果見圖2。

圖1 連翹藥材鑒別的薄層色譜圖

2.3 柴胡薄層色譜鑒別 取本品50 mL，用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用5%Na2HCO3溶液洗滌1次，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液;取柴胡皂苷a對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液;取柴胡對照藥材1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，與供試品溶液同法操作，作為對照藥材溶液;取缺柴胡的陰性制劑50 mL，與供試品同法操作，作為陰性對照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點清晰，分別至日光和紫外光(365 nm)下檢視，結果見圖3。

2.4 荊芥薄層色譜鑒別 取本品50 mL，加石油醚Ⅱ(60～90℃)提取2次，每次20 mL，合并石油醚Ⅱ提取液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液;取荊芥對照藥材1 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振搖20 min，放置過夜，濾過，濾液揮至1 mL，作為對照藥材溶液;取缺荊芥的陰性制劑50 mL，與供試品溶液同法制成，作為陰性對照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(8.5∶1.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點清晰，結果見圖4。

圖2 白花蛇舌草特征鑒別的薄層色譜圖

圖3 柴胡特征鑒別的薄層色譜圖

2.5 連翹苷含量測定

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性 色譜柱:Kromasil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-0.1%磷酸(25∶75);檢測波長:277 nm［2］;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;理論塔板數(shù):按連翹苷峰計算應不低于3 500。

2.5.2 溶液制備 精密稱取連翹苷對照品2 mg，至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得0.20 mg/mL的對照品溶液;精密量取樣品1 mL，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，加置中性氧化鋁柱(100-200目，2 g，內徑1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，濾液作為供試品溶液;取缺連翹的陰性溶液1 mL，同法操作，作為陰性對照溶液。

2.5.3 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，進行色譜測定，結果樣品和對照品在同一保留時間有相同的波峰出現(xiàn)。而陰性對照溶液則無相應的峰，證明陰性對照不干擾測定，可作為含量測定專屬。

2.5.4 線性關系考察 在上述色譜條件下，分別進樣1，2，5，10，20 μL 進行測定，以進樣量 X(μL)分別對應峰面積 Y進行線性回歸，得回歸方程 Y=145 909 X－18 848(r=0.999 8)。結果表明:連翹苷進樣量在0.2～4 μg范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.5 檢測限、定量限 取2.1項下對照品溶液，用甲醇逐級稀釋后檢測，當信噪比S/N≈3時計算檢測限，信噪比S/N≈10時計算定量限，在該色譜條件下，連翹苷檢測限7.2 ng，定量限18.6 ng。

圖4 荊芥鑒別的薄層色譜圖

2.5.6 精密度試驗、重復性試驗、穩(wěn)定性試驗 吸取對照品溶液與供試品溶液，各進樣5次。連翹苷對照品5次測定的峰面積平均值為1 392 899，RSD為0.45%;供試品中連翹苷的平均值為1 476 288，RSD為0.95%;說明儀器精密度良好，方法重復性好。取同一批供試品溶液(批號為131011)，制備后室溫(25 ℃)放置，分別于0，1，2，4，8，16，24，48 h 進樣測定，結果連翹苷峰面積的RSD為1.25%，表明慢性咽炎合劑供試品溶液在48 h內比較穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密量取0.5 mL，已知連翹苷含量的慢性咽炎合劑(批號為131011)9分，分別精密加入0.2 mg/mL連翹苷對照品溶液相當于慢性咽炎合劑中連翹苷含量的80%，100%，120%，每個濃度平行做3分，進行測定，計算加樣回收率，見表1。

2.5.8 樣品含量測定 取5批不同批號的慢性咽炎合劑制劑，每批2分，每分平行測定2次，取平均值，計算樣品中連翹苷的含量，結果130 614，130 620，130 925，131 010，131 011 的含量測定結果為 0.582，1.401，1.204，0.770，1.133。

3 討論

連翹薄層色譜中用5%香草醛硫酸作為顯色也能達到顯色效果，但是顯色后斑點容易擴散，比較兩種顯色劑，最終選用10%硫酸乙醇［3］。

白花蛇舌草的藥用成分為極性較大的黃酮類、蒽醌類、萜類、甾醇類［4］，因此選擇極性大的正丁醇作為展開劑，加入濃氨可以改善斑點，減少拖尾。

板藍根也是該制劑中一個用量比較大的藥味，RS-告依春是代表性有效成分之一，是反應板藍根藥材質量的重要指標［5］，但是找不到合適的分離方法和專屬的顯色劑，所以最終放棄了板藍根的鑒別項。

表1 連翹苷的加樣回收率實驗結果

本實驗還進行了柴胡薄層色譜鑒別和荊芥薄層色譜鑒別，結果:柴胡鑒別項嘗試了乙酸乙酯-甲酸-水(20∶3∶1)和乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)展開系統(tǒng)［6］，發(fā)現(xiàn)后一個分離效果更好，無論日光還是紫外光下都斑點清晰。荊芥的化學成分主要是揮發(fā)油類、萜類、黃酮類、酚酸類［7］，用石油醚Ⅱ提純后，獲得滿意的分離效果。

連翹苷在堿性環(huán)境下(pH 9.4)極其不穩(wěn)定，中性條件下60℃左右時較為穩(wěn)定，在酸性環(huán)境下(pH 4.03)穩(wěn)定［8］，故在流動相中加入少量磷酸，以乙腈－0.1%磷酸(25∶75)作為流動相，連翹苷的出峰時間在8 min左右，且峰形好，分離度高，因此本實驗采用此體系為流動相。

經(jīng)過對氧化鋁用量、洗脫試劑及其用量進行考察發(fā)現(xiàn)，氧化鋁用量1，2 g結果相似，但1 g雜質峰較多，3，4 g氧化鋁對連翹苷含量有一定影響，故選用2 g氧化鋁;分別用70%甲醇和70%乙醇進行洗脫，結果基本相同，但甲醇毒性較乙醇大，因此選用70%乙醇作為洗脫溶劑。

白花蛇舌草也是本制劑方中君藥，廣東省中藥標準中［9］把熊果酸、齊墩果酸含量作為白花蛇舌草的質量控制指標，本制劑中也能檢測到熊果酸和齊墩果酸，但是由于連翹、荊芥、崗梅根中都含有熊果酸和齊墩果酸成分［10-11］，因此測定熊果酸和齊墩果酸含量對于藥味的用量控制意義不大。

醫(yī)院制劑要走現(xiàn)代化生產之路，發(fā)展自己的特色制劑，走出困境實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，醫(yī)院制劑的發(fā)展也將有力促進醫(yī)院藥學學科的整體發(fā)展，提高醫(yī)院的醫(yī)療水平，同時也從另一方面提升醫(yī)院的知名度和影響力，創(chuàng)造良好的社會效益和經(jīng)濟效益［12］。

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