布圖雅， 孫勤暖， 廣布加甫·藏登， 烏日嘎

（1.內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古呼和浩特010059；2.內蒙古醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，內蒙古呼和浩特010059；3.新疆醫(yī)科大學校醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

蒙藥尼如哈優(yōu)化劑對潰瘍性結腸炎相關癌小鼠的一般情況和結腸組織病變的影響

布圖雅1， 孫勤暖2， 廣布加甫·藏登3， 烏日嘎1

（1.內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古呼和浩特010059；2.內蒙古醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，內蒙古呼和浩特010059；3.新疆醫(yī)科大學校醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

目的探討尼如哈優(yōu)化劑對潰瘍性結腸炎相關癌的防治作用。方法98只Balb/c小鼠隨機分空白組、模型組、優(yōu)化劑高、中、低劑量治療組，傳統(tǒng)劑治療組，柳氮磺吡啶治療組7組，每組10只；正常組除外，各組以AOM/DSS復合法復制模型，從第9周開始模型組予等劑量生理鹽水灌腸，治療各組分別予相應的藥液進行灌腸治療，共11周。實驗第20周末將全部小鼠處死取全結腸，肉眼及光鏡下觀察其結腸組織形態(tài)學改變及異常隱窩的變化。期間每周一次觀察小鼠一般情況。結果模型組小鼠結腸肉眼改變以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹?。病理改變以低級別上皮內瘤變和/或高級別上皮內瘤變?yōu)橹?；低、中劑量組肉眼改變均以單發(fā)或少數息肉狀隆起性病變?yōu)橹?。鏡下以增生性息肉改變?yōu)橹?；高劑量組、柳氮磺吡啶組肉眼改變均以結腸黏膜充血、水腫為主。鏡下改變均以腺體增生為主，未見潰瘍及明顯的異常隱窩及上皮內瘤變。與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01）?？瞻捉M小鼠情況良好，攝食量、大便正常；模型組小鼠體質量逐漸減輕，倦怠拱背、有黏液血便，并出現(xiàn)脫肛；尼如哈治療各組小鼠體質量和食量不同程度增加、血便次數明顯減少。結論蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑可用于防治潰瘍性結腸炎相關癌。

蒙醫(yī)；尼如哈優(yōu)化劑；結腸炎相關性結腸癌；上皮內瘤變

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一。其中約1/4的患者其病因及發(fā)病機制與慢性炎癥相關［1］。研究表明，在結腸癌出現(xiàn)之前，至少要經過數十年的癌前演變期［2］。而慢性潰瘍性結腸炎伴上皮內瘤變是主要的結腸癌前病變。因此，探索結腸炎相關性結腸癌的有效防治措施，防止結腸炎向結腸癌演變是一個重要的課題［3］。

蒙醫(yī)認為潰瘍性結腸炎相關性結腸癌 （CAC）屬大腸“血痞病”范疇，是由大腸 “寶如病”遷延不愈導致的一類 “痞病”。尼如哈優(yōu)化劑為筆者結合蒙醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理學研究，整理、分析蒙醫(yī)治療大腸寶如病的尼如哈劑，進行優(yōu)化而成。應用于輕、中度潰瘍性結腸炎的治療取得了良好的臨床療效［4］?；诖?，本實驗應用AOM/DSS復制小鼠潰結相關癌變模型，期望通過觀察各組CAC小鼠一般情況及結腸組織形態(tài)學變化，探討尼如哈優(yōu)化劑對其一般情況的改善及結腸組織的保護作用，進而為臨床防治CAC提供可參考的實驗數據和安全有效的治療方法。

1 材料

1.1 實驗動物 Balb/c雄性小鼠，清潔級，98只。購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。

1.2 主要試劑及儀器 氧化偶氮甲烷（AOM）（美國SIGMA公司，批號A5486-25MG）；葡聚糖硫酸鈉 （DSS分子質量50 000）（美國AMERESCO公司，批號0918-10）；甲醛、無水乙醇購自天津國藥集團 （貨號 HX0174，HX0046）；蘇木素細胞染色液、伊紅染色液購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；組織切片石蠟塊購自上海華靈公司（GCHC0004）；YD-12G自動脫水機；YD-6D包埋機；RM2135 Leica切片機；HI1210Leica攤片機；烘片機。

1.3 實驗藥物 尼如哈傳統(tǒng)劑：載于 《甘露四部》，由訶子、枇杷葉、茜草、秦艽花、藜蘆、大黃組成。購自內蒙古醫(yī)科大學附屬中蒙醫(yī)院。

尼如哈優(yōu)化劑：由訶子、石榴、蓽茇等為主的方劑。購自內蒙古醫(yī)科大學附屬中蒙醫(yī)院。

尼如哈傳統(tǒng)劑及優(yōu)化劑的制備：稱定質量、粉碎、梯度 （100～250目孔）過篩。用蒸餾水煮沸后靜置，取上清液備用。

柳氮磺吡啶腸溶片 （國藥準字 H31020840，批號22120608），上海福達制藥有限公司生產。

2 方法

2.1 模型制備及分組處理 參照文獻［5］所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周。按體質量隨機分為空白組、模型組、優(yōu)化劑高、中、低劑量治療組、傳統(tǒng)劑治療組、柳氮磺吡啶治療組7組，每組10只。小鼠腹腔注射1次1 g/L質量濃度的AOM（10 mg/kg），繼而飲用添加3%DSS飲用水1周，再飲用正常飲用水兩周為一個循環(huán)。正常組除外，其余各組重復上述循環(huán)3次。第9周開始模型組予等劑量生理鹽水，治療組按實驗動物與人的劑量換算比率，分別予450 mg/mL、225mg/mL、112.5mg/mL優(yōu)化劑、450mg/mL傳統(tǒng)劑和30 m g/mL柳氮磺吡啶。每次灌腸藥量為0.1 mL/10 g［6］，每日一次灌腸，共治療11周。

2.2 標本采集 全部小鼠于實驗第20周末處死，取出全結腸，沿縱軸切開，用生理鹽水迅速沖凈后置于標本體積10倍以上的10%中性福爾馬林溶液中固定，備測。

2.3 指標檢測

2.3.1 結腸大體損傷的評分 將小鼠結腸向上平展于白色硬板，用精密電子秤秤取其凈質量，用游標卡尺測量其長度，隨即大頭針固定，用放大鏡觀察黏膜的損傷程度、炎癥、潰瘍以及腫瘤發(fā)生等變化并予以評分。評分標準見表1［7］。

表1 結腸大體損傷評分標準

2.3.2 異常隱窩 用0.38% （體積分數）美藍將結腸染色，解剖顯微鏡下計數異常隱窩（aberrant crypt，AC）的個數，并取正面圖像。AC的診斷標準［8］： （1）異常隱窩所占面積約是周圍正常隱窩的2～3倍； （2）異常隱窩的表皮層增厚；（3）異常隱窩的開口往往輕度變長；（4）與正常隱窩之間的間隔區(qū)相比，異常隱窩與正常隱窩之間的間隔區(qū)增大。

2.3.3 結腸病理改變的觀察 將固定好的結腸流水沖洗24 h后放置生物脫水機進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片 （厚度4μm），行常規(guī)HE染色，封片。光鏡下觀察結腸黏膜組織形態(tài)學改變情況。組織學損傷評分標準見表2［9］。

表2 結腸病理組織學損傷評分標準

2.3.4 上皮內瘤變的評價標準［10］低級別上皮內瘤變指結構和細胞學異常限于上皮的下半部，相當于輕度和中度異型增生；高級別上皮內瘤變則指結構和細胞學異常擴展到上皮的上半部，乃至全層，相當于重度異型增生和原位癌。

2.3.5 一般情況的觀察 自實驗開始每周一次觀察各組小鼠的攝食攝水量、毛發(fā)、體質量、便血及死亡等變化。

3 結果

3.1 肉眼觀察結腸黏膜損傷情況 正常小鼠組結腸黏膜光滑，未見充血，水腫及糜爛潰瘍改變；模型組、低劑量組小鼠結腸肉眼改變均以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，組間比較無顯著差異 （P＞0.05）；中劑量組以伴有單發(fā)或少數息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，偶見潰瘍形成，中劑量組與模型組和低劑量組之間比較，有顯著差異 （P＜0.05）。高劑量組、柳氮磺吡啶組均以結腸黏膜充血、水腫為主，未見明顯潰瘍。與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01），組間比較無顯著差異 （P＞0.05），與中劑量組比較有差異 （P＜0.05），見表3。

3.2 小鼠結腸黏膜光鏡下病理變化 正常組小鼠結腸黏膜上皮完整，未見充血水腫及糜爛潰瘍，腺體排列規(guī)則，含多量杯狀細胞；模型組、低劑量組小鼠均以腺體增生、杯狀細胞消失，異常隱窩呈不規(guī)則分支，以低和/或高級別上皮內瘤變?yōu)橹?，組間無顯著差異 （P＞0.05）。中劑量組以增生性息肉改變?yōu)橹?，杯狀細胞明顯減少，異常隱窩偶見。中劑量組與模型組和低劑量組之間比較，有顯著差異（P＜0.05）；高劑量組、柳氮磺吡啶組鏡下改變均以黏膜上皮脫落、杯狀細胞減少，腺體增生為主，未見糜爛潰瘍及明顯的異常隱窩和上皮內瘤變，與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01），組間無顯著差異 （P＞0.05）、與中劑量組比較有差異 （P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 小鼠結腸黏膜肉眼及光鏡下?lián)p傷評分 （）

表3 小鼠結腸黏膜肉眼及光鏡下?lián)p傷評分 （）

注：與模型對照組比較，*P＜0.01

只 肉眼損傷評分 光鏡損傷評分正常對照組組別 小鼠/ 8 0 0模型對照組 8 9.00±0.75 8.25±1.03尼如哈優(yōu)化劑高劑量組 8 3.00±1.75 3.13±0.53*尼如哈優(yōu)化劑中劑量組 8 2.50±1.75 5.75±0.46*尼如哈優(yōu)化劑低劑量組 8 2.50±1.00 5.18±1.19*柳氮磺吡啶組 8 2.50±1.75 5.13±0.75*尼如哈傳統(tǒng)劑量組 8 3.00±0.73 5.12±0.64*

圖1 尼如哈優(yōu)化劑對結腸炎相關性結腸癌小鼠結腸黏膜癌變的影響

3.3 形態(tài)學改變及異常隱窩變化 （ACF）結果 正常組小鼠結腸未見異常隱窩。模型組可見隱窩開口呈三角、長橢圓等形狀并擴大；其大小不等，多數含3個以上的AC；隱窩間脊增寬，異常隱窩與周圍正常隱窩界限分明。隱窩上皮細胞胞核核分裂多、排列擁擠、增大擴展至腸腺的腔面，胞漿深染（圖2），治療組形成形態(tài)學改變及異常隱窩的平均數量均少于模型組，且多為異型性小形態(tài)學改變及異常隱窩。高劑量組，柳氮磺吡啶組偶見增生性隱窩，異常隱窩數明顯減少，高劑量組、柳氮磺吡啶組與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01）見表4、圖2。

表4 各組小鼠結腸形態(tài)學改變及異常隱窩形成情況（）

表4 各組小鼠結腸形態(tài)學改變及異常隱窩形成情況（）

注：與模型對照組比較，*P＜0.01

組別 小鼠/只 每鼠平均ACF/個正常對照組80模型對照組 8 17.75±2.23尼如哈優(yōu)化劑高劑量組 8 5.53±2.50*尼如哈優(yōu)化劑中劑量組 8 6.45±1.56*尼如哈優(yōu)化劑低劑量組 8 5.55±1.75*柳氮磺吡啶組 8 5.53±2.55*尼如哈傳統(tǒng)劑量組4.52±1.75 8

3.4 小鼠一般情況 正常組小鼠情況良好，攝食量多，大便正常；模型組小鼠體質量逐漸減輕，倦怠拱背、精神萎靡、體毛黯淡無光，有黏液血便，并出現(xiàn)脫肛，尼如哈治療組的小鼠體質量和食量不同程度增加，體毛較有光澤，血便次數明顯減少。

4 討論

4.1 潰瘍性結腸炎相關癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟演變的模式。研究顯示，潰瘍性結腸炎患者結腸上皮高級別或低級別內瘤變是發(fā)生在進展期結腸癌前，被認為是癌前病變［11］。在病程長，病變累及全結腸的潰瘍性結腸炎患者結腸上皮癌變的危險性增加［12］。對高風險的患者使用療效好且毒副作用較小的天然合成藥物進行干預，可達到逆轉癌前病變、降低腫瘤的發(fā)生率并能避免手術治療后的復發(fā)率［3］。

4.2 蒙醫(yī)認為，該病是由大腸 “寶如”病遷延不愈而引發(fā)的大腸 “血痞”病。而 “寶如”為熱邪積于大腸而引起的聚會性慢性?。?3］，久病致痞。應用內服藥和腸療-尼如哈療法防治該病，取得了良好療效，積累了寶貴的治療經驗［14-15］。

圖2 尼如哈優(yōu)化劑對結腸炎相關性結腸癌小鼠形態(tài)學改變及異常隱窩形成的影響

4.3 尼如哈優(yōu)化劑是筆者通過前期工作，基于對大腸寶如病的病因病機的重新認識，結合蒙醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理學研究，對包括原方在內的治療大腸寶如病的尼如哈劑進行了優(yōu)化，得出的以訶子、石榴、蓽茇、枇杷葉、茜草、藜蘆、秦艽花、大黃等組成的方劑。方中訶子為蒙藥藥中之王［16］。研究證明，其提取物具有抗菌、抗病毒等多種藥理活性［17］。藜蘆、大黃、秦艽花［18］以及茜草、枇杷葉［19］也具抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用。蓽茇、大黃、秦艽還具有抗氧化作用以及免疫調節(jié)作用［20］。通過實驗我們可以明確尼如哈優(yōu)化劑防治潰結癌變的生物學效應。由此初步推測，對高危險因素的患者應用尼如哈優(yōu)化劑可預防潰結相關癌變是有力的，具有深入研究的價值。

4.4 蒙醫(yī)藥是傳統(tǒng)實踐經驗的總結，理論基礎和所用的藥物與西醫(yī)有著很大的不同。治療結腸炎相關性結腸癌方面有獨特的療效，在許多方面可補西醫(yī)之不足。隨著臨床上蒙西醫(yī)結合的廣泛開展，更加突出了蒙醫(yī)藥在治療結腸炎相關性結腸癌的重要地位。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0883-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.044

2014-02-14

內蒙古自治區(qū)科技計劃項目 （kjt11sf07）

布圖雅 （1973—），女 （蒙古族），博士，教授，碩士生導師。Tel：13354711577；E-mail：butuyatl@126.com