侯 茜， 張秋菊， 劉永琦， 張 帆

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

低氧環(huán)境下黃芪注射液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響

侯 茜， 張秋菊， 劉永琦， 張 帆

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

目的探討低氧環(huán)境下黃芪注射液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （hMSCs）體外增殖的影響。方法將體外培養(yǎng)的hMSCs分成常氧組和低氧組，分別用0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黃芪注射液干預(yù)48 h，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，四甲基偶氮唑鹽 （MTT）法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果低氧環(huán)境下，25、50、100、150、200μg/mL的黃芪注射液均可明顯促進(jìn)hMSCs的增殖 （P＜0.01），其中50μg/mL黃芪注射液的增殖效果最顯著（P＜0.01），達(dá)600μg/mL時(shí)產(chǎn)生抑制作用；常氧環(huán)境下，黃芪注射液以300μg/mL對(duì)hMSCs的促增殖作用最為明顯 （P＜0.01），25、50、100、150、200、600、1 000μg/mL黃芪注射液均抑制hMSCs的增殖。結(jié)論黃芪注射液在一定質(zhì)量濃度下可促進(jìn)體外培養(yǎng)的hMSCs的增殖。低氧環(huán)境下，低質(zhì)量濃度促進(jìn)其增殖；常氧環(huán)境下，低質(zhì)量濃度抑制其增殖。

黃芪注射液；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （hMSCs）；低氧培養(yǎng)；增殖

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，hMSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能，將其作為種子細(xì)胞用于基因治療和細(xì)胞治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。hMSCs主要來(lái)源于骨髓，在骨髓內(nèi)的氧濃度為1%～7%之間［1］，是一種生理性的低氧環(huán)境，hMSCs移植后治療效能的發(fā)揮也與損傷部位的低氧環(huán)境密切相關(guān)。但目前hMSCs體外培養(yǎng)和增殖分化的研究大多是在常氧條件下進(jìn)行的，忽視了體內(nèi)一些生理、病理狀態(tài)中，出現(xiàn)細(xì)胞局部微環(huán)境低氧的真實(shí)情況。如何在體外低氧環(huán)境下促進(jìn)hMSCs的增殖、分化，是目前hMSCs研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

黃芪是一味歷史悠久、臨床上最常用的 “扶正固本，補(bǔ)中益氣”的中藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等多種功效。近年來(lái)，有關(guān)研究提示黃芪與hMSCs間有密切關(guān)系［2-4］，少量研究結(jié)果表明黃芪具有調(diào)控hMSCs增殖、分化和遷移的作用［5］。但低氧環(huán)境下黃芪注射液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與干細(xì)胞研究相結(jié)合，在低氧環(huán)境下用中藥黃芪干預(yù)hMSCs培養(yǎng)過(guò)程，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，探討低氧環(huán)境下黃芪對(duì)hMSCs體外增殖的影響，為臨床治療運(yùn)用黃芪注射液提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bonemarrowderived mesenchymal stem cells，hMSCs），購(gòu)自Cyagen Biosciences Inc（Catalog Number：HUXMA-01001）。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（HYCLONE NYB0813），0.25%胰蛋白酶 （GIBCO 20130708217）；胎牛血清 （HYCLONE NXA0544）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（索萊寶科技有限公司 0793）；二甲基亞砜 （索萊寶科技有限公司0231）；黃芪注射液 （神威藥業(yè)集團(tuán)，10mL黃芪注射液相對(duì)于原藥材20 g）。

1.3 儀器 三氣培養(yǎng)箱 （力康發(fā)展有限公司HF-100），二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO MCO-18AIC（UV））；超凈工作臺(tái) （天津市泰斯特儀器有限公司CJ-2S）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS IX81）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIORAD IMARK1509）；往復(fù)式水浴搖床 （上海智誠(chéng)分析儀器制造公司ZHEY-110X30）等。

2 方法

2.1 hMSCs體外培養(yǎng) 將hMSCs傳于25 cm培養(yǎng)瓶中，每瓶3 m L。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每2天換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合度約達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察傳代細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將體外培養(yǎng)的hMSCs分為常氧組和低氧組。常氧組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱 （21%O2）中培養(yǎng)；低氧組置于37℃、三氣培養(yǎng)箱 （5%O2）中培養(yǎng)。黃芪注射液分為：0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL十一個(gè)劑量。

2.3 MTT比色法檢測(cè)hMSCs增殖 將培養(yǎng)的hMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整其細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔含細(xì)胞懸液100μL。按實(shí)驗(yàn)分組分別置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱及37℃、三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，分別加入0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黃芪注射液干預(yù)48 h。終止前4 h，各組于每孔加5 mg/mL MTT20μL，繼續(xù)孵育4 h，棄除孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲基亞砜150μL，將培養(yǎng)板置水平搖床上，低速震蕩20 m in使沉淀充分溶解后，選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 hMSCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，可見(jiàn)hMSCs培養(yǎng)24 h后開(kāi)始貼壁，3 d后細(xì)胞增多，形態(tài)均一，為成纖維細(xì)胞樣，呈梭形或紡錘形生長(zhǎng)。6～7 d后細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，以長(zhǎng)梭形為主，細(xì)胞分布均勻，排列有序，邊界清晰，旋渦樣生長(zhǎng)。常氧和低氧環(huán)境下的hMSCs的形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別。

3.2 MTT比色法檢測(cè)hMSCs增殖結(jié)果 常氧環(huán)境下，黃芪注射液質(zhì)量濃度在25～200μg/m L范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，均抑制hMSCs的增殖（P＜0.01），300μg/m L的黃芪注射液對(duì)hMSCs具明顯促增殖作用 （P＜0.01），隨質(zhì)量濃度增大時(shí)增殖作用降低，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)600、1 000μg/mL時(shí)產(chǎn)生抑制作用 （P＜0.01），見(jiàn)圖1。低氧環(huán)境下，25、50、100、150、200μg/mL的黃芪注射液均可明顯促進(jìn)hMSCs的增殖（P＜0.01），其中以50μg/mL黃芪注射液的增殖效果最顯著 （P＜0.01），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)600、1 000μg/mL時(shí)產(chǎn)生抑制作用 （P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖1 常氧下 （21%氧濃度）不同質(zhì)量濃度黃芪注射液對(duì)hMSCs增殖的影響

圖2 低氧下 （5%氧濃度）不同質(zhì)量濃度黃芪注射液對(duì)hMSCs增殖的影響

4 討論

hMSCs主要來(lái)源于骨髓，骨髓是一典型的低氧環(huán)境，有學(xué)者將hMSCs的生長(zhǎng)環(huán)境歸于生理性低氧。除正常的生理性低氧外，一些病理性的情況也往往造就低氧環(huán)境，動(dòng)員hMSCs聚集修復(fù)的損傷組織如骨壞死、心肌梗塞處，因?yàn)槿毖毖跏沟貌∽兘M織長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境，而hMSCs移植后治療效能的發(fā)揮也與損傷部位的低氧環(huán)境密切相關(guān)。hMSCs正是歸巢于這樣的低氧環(huán)境中，分化成熟，修補(bǔ)缺損，彌補(bǔ)功能［6］?？梢?jiàn)hMSCs在自然所處的環(huán)境中以低氧為主，低氧是其在正常生理狀態(tài)下或某些病理狀態(tài)中所處環(huán)境的一個(gè)基本要素。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于中藥黃芪干預(yù)hMSCs，對(duì)其增殖的影響研究不多。胡琳等［7］體外加黃芪注射液 （藥物濃度梯度為：原液，5、10、15、20倍液）培養(yǎng)大鼠hMSCs24、48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對(duì)hMSCs的增殖無(wú)顯著作用。譚艷芳等［8］加入不同濃度的黃芪甲苷與大鼠hMSCs共培養(yǎng)24、48、72 h后，結(jié)果以200 mg/mL黃芪甲苷組72 h增殖作用最明顯 （P＜0.05）。黃進(jìn)等［9］研究表明，黃芪多糖對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)72 h誘導(dǎo)培養(yǎng)后，有促進(jìn)增殖的作用。其中，以1 mg/mL黃芪多糖促增殖作用最為明顯（P＜0.01），2、3 mg/mL黃芪多糖也具有促進(jìn)hMSCs增殖的作用（P＜0.05），而5 mg/mL黃芪多糖組hMSCs增殖最少。本課題組通過(guò)MTT比色法分析不同質(zhì)量濃度黃芪注射液對(duì)體外培養(yǎng)的hMSCs增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，低質(zhì)量濃度的黃芪注射液促進(jìn)hMSCs的增殖，以50μg/mL黃芪注射液培養(yǎng)hMSCs能表現(xiàn)出更加旺盛的增殖能力 （P＜0.01）；常氧環(huán)境下，低質(zhì)量濃度的黃芪注射液抑制hMSCs的增殖，300μg/m L的黃芪注射液對(duì)hMSCs具明顯促增殖作用 （P＜0.01）。

黃芪是補(bǔ)益藥物中應(yīng)用最為廣泛的中藥，也是許多中藥復(fù)方中的主藥。黃芪性溫味甘，入肺、歸脾經(jīng)，生用能益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫；炙用能補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷。目前對(duì)黃芪藥材及含君藥黃芪的中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)均以黃芪皂苷Ⅳ （黃芪甲苷）作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)［10］。藥理研究表明，黃芪注射液中主要有黃芪皂苷、黃芪酮、黃芪多糖3種不同的化學(xué)成分［11］，具有一定免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗突變、抗腫瘤等作用。我國(guó) 《本草綱目》記載黃芪可治療一切氣衰、血虛之證。干細(xì)胞具先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式［12-14］，中醫(yī)理論認(rèn)為“氣能生血”、“精血同源”，黃芪補(bǔ)氣、生髓、化血，這為促進(jìn)hMSCs體外增殖提供了理論依據(jù)。

本研究只是初步探索了低氧條件下黃芪注射液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響，并且未能以黃芪中提取而得的黃芪皂苷作為平行對(duì)照。低氧培養(yǎng)也只用5%的氧氣，未用3%的氧氣培養(yǎng)，繼續(xù)降低氧濃度是否可增加細(xì)胞增殖等，還有待于進(jìn)行更深入的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0873-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.041

2014-01-29

甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目 （BH2012-035）

侯 茜（1984—），女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究。Tel：（0931）8765414，E-mail：houqian@gszy.edu.cn