黃立華， 王 建， 吳明權(quán)， 朱璋佩， 高天慧， 陸小華

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137）

［制 劑］

遠(yuǎn)志、厚樸配伍對(duì)其活性成分在大鼠腸段吸收的影響

黃立華， 王 建*， 吳明權(quán)， 朱璋佩， 高天慧， 陸小華

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137）

目的研究遠(yuǎn)志和厚樸配伍對(duì)其活性成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ，和厚樸酚，厚樸酚在大鼠不同腸段的吸收影響。方法采用在體單向腸灌流模型，用重量法校正灌流液體積，通過(guò)HPLC-DAD測(cè)定腸灌流液中的被測(cè)成分質(zhì)量濃度，以及P-糖蛋白 （P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）抑制劑對(duì)吸收的影響。結(jié)果配伍組細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在空腸、結(jié)腸的Ka、Papp值均顯著低于遠(yuǎn)志組 （P＜0.05，P＜0.01），遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在各腸段的Ka、Papp值與遠(yuǎn)志組比較均有減小趨勢(shì)；配伍組和厚樸酚、厚樸酚的Ka、Papp值與厚樸組比較均有增大趨勢(shì)。加入不同P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米后，各組中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和厚樸酚的Ka值和中、高濃度組中厚樸酚的Ka值均顯著高于空白組（P＜0.05，P＜0.01）。加入MRP2抑制劑吲哚美辛后，各組中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷及中、高濃度組中遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ的Ka、Papp值均極顯著高于空白組 （P＜0.01），和厚樸酚與厚樸酚的Ka、Papp值均有高于空白組的趨勢(shì)。結(jié)論厚樸能抑制遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在空腸和結(jié)腸的吸收，但受P-gp和MRP2外排影響，提示兩成分可能是P-gp和MRP2的底物；而遠(yuǎn)志能促進(jìn)厚樸中和厚樸酚、厚樸酚的吸收，但均不是P-gp和MRP2的底物，遠(yuǎn)志和厚樸配伍不宜與P-gp和MRP2酶抑制劑同用。

遠(yuǎn)志；厚樸；配伍；腸吸收；在體單向腸灌流；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷；遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ；和厚樸酚；厚樸酚；P-糖蛋白；多藥耐藥相關(guān)蛋白2

遠(yuǎn)志與厚樸均首載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，是臨床常用中藥?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志常規(guī)用量偶可引起輕度惡心、胃腸脹氣；大劑量則可引起惡心、嘔吐、腹瀉、溶血等不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為胃腸運(yùn)動(dòng)障礙及黏膜損傷。課題組前期研究顯示，遠(yuǎn)志有抑制胃腸動(dòng)力的副作用。楊偉峰等［1］研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志總皂苷能顯著抑制胃電振幅和小腸電慢波頻率，且能顯著抑制小鼠胃排空，抑制腸推進(jìn)，且副作用強(qiáng)于等量生遠(yuǎn)志。為了降低遠(yuǎn)志胃腸抑制作用，課題組［2］采用遠(yuǎn)志與厚樸配伍法，發(fā)現(xiàn)厚樸能緩解遠(yuǎn)志胃動(dòng)力障礙副作用，顯著緩解遠(yuǎn)志胃腸動(dòng)力抑制副作用，并保存了遠(yuǎn)志安神益智、鎮(zhèn)咳化痰的功效，達(dá)到了 “減副存效”的目的。

課題組［3］還從化學(xué)角度對(duì)遠(yuǎn)志厚樸配伍后主要指標(biāo)性成分的含量測(cè)定和指紋圖譜進(jìn)行了比較，顯示酚類(lèi)物質(zhì)和苷類(lèi)成分均無(wú)顯著性變化且也未發(fā)現(xiàn)新成分。本實(shí)驗(yàn)以遠(yuǎn)志厚樸及其配伍為研究對(duì)象，以遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ，厚樸中和厚樸酚與厚樸酚為指標(biāo)性成分或有效成分，以及加入不同的抑制劑后，探討各成分及抑制劑在大鼠不同腸段的吸收特性，以及配伍前后厚樸緩解遠(yuǎn)志胃腸動(dòng)力障礙機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器）；BT101L恒流智能蠕動(dòng)泵 （保定雷弗流體科技有限公司）；BP211D型電子分析天平 （北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司）；UPH-1-10T優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；TG16-W微量高速臺(tái)式離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SC-15超級(jí)恒溫槽 （上海新芝生物技術(shù)研究所）；KQ-600 DE型數(shù)控超聲波清洗器 （40 kHz，600 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 遠(yuǎn)志和厚樸均購(gòu)于西南藥都中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定分別為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根及木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.etWils.的干燥干皮。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚、厚樸酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111849-201303、 111850-201203、 110730-201112、110729-200412）；鹽酸維拉帕米（verapamil hydrochloride，VH，批號(hào)100223-200102）、吲哚美辛（indometacin，IT，批號(hào)100258-200904）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；戊巴比妥鈉 （北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝，批號(hào)060222）；乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 健康SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～270 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（川）2013-24。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室（NOTCM-09-315）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液的制備

2.1.1 Krebs-Ringer營(yíng)養(yǎng)液（簡(jiǎn)稱(chēng)K-R液）的制備［4］稱(chēng)取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl2·6H2O 0.043 g，于1 000 mL量瓶中，先加純化水溶解，再一邊攪拌一邊加CaCl20.37 g，D-glucose 1.40 g用時(shí)臨時(shí)加入混勻，加超純水定容，pH 7.4。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 分別取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷10.40 mg、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ10.00 mg、和厚樸酚12.60 mg、厚樸酚18.80 mg對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置10mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷1.04 mg/mL、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ1.00 mg/mL、和厚樸酚1.26 mg/m L、厚樸酚1.88 mg/mL，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得，4℃冷藏，備用。

2.1.3 供試液的配制 稱(chēng)取遠(yuǎn)志粉末 （過(guò)三號(hào)篩）1 kg，加90%乙醇回流提取2 h，提取1次，過(guò)濾，減壓回收溶劑，蒸干得遠(yuǎn)志浸膏290 g。稱(chēng)取遠(yuǎn)志浸膏151 g，將其置于500 mL 1%的NaOH溶液中，加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4～5。將酸化后的堿水解溶液以D101大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行柱層析，先用去離子水洗脫至流出液基本無(wú)色，棄去洗脫液；再用95%乙醇洗脫至流出液基本無(wú)色，減壓回收溶劑，蒸干得遠(yuǎn)志皂苷水解產(chǎn)物33.0 g（細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為209 mg/g，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.63 mg/g）。

取厚樸粉末 （過(guò)三號(hào)篩）2 kg，精密稱(chēng)定，用90%乙醇回流提取2 h，提取1次，趁熱過(guò)濾，減壓回收溶劑，蒸干得厚樸浸膏210 g（和厚樸酚含有量為36.4 mg/g，厚樸酚含有量為85.4 mg/g）。

精密稱(chēng)取遠(yuǎn)志浸膏0.94 g，置研缽中，加SDS 5.0 g，充分研磨均勻，分次加入K-R液，充分研磨混勻，于1 000 m L量瓶中，定容，15 min超聲充分均勻，即得0.94 mg/m L的遠(yuǎn)志供試液（細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為0.20 mg/mL，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ為1.53 μg/mL），即相當(dāng)于制成每1mL溶液中含遠(yuǎn)志原生藥14.8 mg。取厚樸浸膏3.12 g，同法制成3.12 mg/mL的厚樸供試液（和厚樸酚為0.11 mg/m L，厚樸酚為0.27 mg/mL），即相當(dāng)于制成每1 mL溶液中含厚樸原生藥29.6 mg。精密稱(chēng)取遠(yuǎn)志皂苷水解產(chǎn)物0.94 g，厚樸浸膏3.12 g，同法制成遠(yuǎn)志和厚樸的質(zhì)量濃度分別為0.94 mg/mL和3.12 mg/mL的配伍供試液。

2.1.4 含P-gp抑制劑的配伍供試液的配制 精密移取鹽酸維拉帕米貯備液0.2、0.4、2.0 mL，加“2.1.3”項(xiàng)配伍供試液定容至250 mL量瓶中。即得含鹽酸維拉帕米分別為0.05、0.1、0.5 mmol/L的低、中、高濃度組供試液。

2.1.5 含MRP2抑制劑的配伍供試液的配制 取吲哚美辛貯備液0.1、0.2、0.4 mL，精密移取，加 “2.1.3”項(xiàng)配伍供試液定容至250 mL量瓶中。即得含吲哚美辛分別為0.02、0.04、0.08 mmol/L的低、中、高濃度組供試液。

2.2 色譜條件 Inertsil?ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 （A）-0.05%磷酸水溶液 （B），pH為2.3，體積流量1.0 mL/min，梯度洗脫0～5 min，25%～35%A；5～13 min，35%～67%A；13～16 min，67%～90%A；16～17 min，90%A；17～18 min，90%～25%A；18～22 min，25%A，柱溫40℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 210 nm、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ254 nm、和厚樸酚與厚樸酚294 nm。

2.3 灌流液樣品處理 移取灌流液樣品1.0 mL，加入1.0 mL甲醇渦旋2min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液20μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 在體單向腸灌流試驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)前禁食12 h（期間正常飲水）的健康SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液 （40 mg/kg），麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，手術(shù)操作參考文獻(xiàn) ［4-6］，灌流流速為0.28 mL/min，從第一滴供試液滴下開(kāi)始計(jì)時(shí)，前30 min的灌流液舍去，后每隔15 min迅速更換一次裝有供試液的安瓿瓶和用來(lái)收集灌流液的安瓿瓶，稱(chēng)重，計(jì)算泵入供試液的質(zhì)量，稱(chēng)定每15 min內(nèi)收集到流出液的質(zhì)量。直至120 min結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠麻醉處死，輕柔地將被考察的腸段剪下，保持自然長(zhǎng)度，在37℃的0.9%生理鹽水浸潤(rùn)下剪開(kāi)腸段，用手術(shù)絲線附著法測(cè)量其長(zhǎng)度l（cm）和周長(zhǎng)C（cm），測(cè)量過(guò)程盡量迅速且避免牽拉腸段，由周長(zhǎng)計(jì)算腸段的內(nèi)半徑r（cm）。所得灌流液樣本經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚的含有量。

2.5 灌流液體積的校正及統(tǒng)計(jì)分析 參照文獻(xiàn)［7］，采用重量法對(duì)灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正，消除其體積變化的影響。按下式計(jì)算Ka和Papp值。

其中，Vin和Vout分別為灌入和收集的供試液體積 （mL）；Cin和Cout分別為進(jìn)口和出口處緩沖液中的藥物質(zhì)量濃度（mg/L）；l和r分別為被考察腸段長(zhǎng)度 （cm）和半徑 （cm）；Vin為灌流速度（mL/min）。

采用Grubbs檢驗(yàn)法對(duì)Ka和Papp值分別進(jìn)行偶然誤差值進(jìn)行取舍，直至無(wú)顯著性誤差。結(jié)果用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取大鼠空白灌流液，空白灌流液加細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚及厚樸酚對(duì)照品，遠(yuǎn)志厚樸配伍腸灌流液，按“2.3”項(xiàng)方法預(yù)處理，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC of d ifferent sam p les

2.6.2 線性與范圍考察 用空白灌流液配制混合樣品，含細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量濃度為1.875、3.75、7.5、15、30、60、120μg/m L；遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ質(zhì)量濃度0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL；和厚樸酚質(zhì)量濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL；厚樸酚質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL。按“2.3”項(xiàng)方法預(yù)處理后，進(jìn)樣測(cè)定。以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚的峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚質(zhì)量濃度 （X）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1，結(jié)果顯示細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚 （HN）及厚樸酚 （MN）線性關(guān)系良好。

表1 線性范圍考察結(jié)果Tab.1 Linear range investigation

2.6.3 精密度試驗(yàn) 分別配制含細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷3.75、15，60μg/mL；遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ0.025、0.1、0.4μg/m L；和厚樸酚6.25、25、100μg/mL；厚樸酚12.5、50、200μg/mL的低、中、高3個(gè)混合濃度灌流液，按 “2.3”方法預(yù)處理后1 d內(nèi)每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)6次，同法連續(xù)測(cè)定7 d。結(jié)果見(jiàn)表2，表明精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚質(zhì)量濃度分別為3.75、15、60μg/mL，0.025、0.1、0.4μg/m L，6.25、25、100μg/mL，12.5、50、200μg/mL的低、中、高3個(gè)混合供試液，按 “2.3”項(xiàng)方法預(yù)處理后，連續(xù)測(cè)定6 d，結(jié)果見(jiàn)表2，表明穩(wěn)定性良好。

2.6.5 回收率試驗(yàn) 分別配制質(zhì)量濃度為3.75、15、60μg/m L，0.025、0.1、0.4μg/mL，6.25、25、100μg/m L，12.5、50、200μg/m L 3種不同質(zhì)量濃度的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚灌流液，按 “2.3”項(xiàng)方法預(yù)處理后，進(jìn)樣測(cè)定并記各成分峰面積，將峰面積代入回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度。結(jié)果見(jiàn)表2，表明低、中、高質(zhì)量濃度的提取回收率均符合要求。

2.7 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚及厚樸酚在大鼠各腸段吸收特性的考察 取SD大鼠隨機(jī)分成遠(yuǎn)志組，厚樸組，配伍組3組，每組6只，分別取 “2.1.3”項(xiàng)下灌流液，按 “2.4”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚與厚樸酚在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，配伍后遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在各腸段吸收均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），而厚樸中和厚樸酚、厚樸酚腸吸收均有增大趨勢(shì)。

表2 精密度、穩(wěn)定性、加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Precision，stability and recovery test

表3 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚（HN）及厚樸酚（MN）在大鼠不同腸段的吸收 （n=6，）Tab.3 Absorption of TF，PT，HN and MN in different intestinal segments in rats（n=6，）

表3 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚（HN）及厚樸酚（MN）在大鼠不同腸段的吸收 （n=6，）Tab.3 Absorption of TF，PT，HN and MN in different intestinal segments in rats（n=6，）

注：與配伍組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與回腸段配伍組比較，#P＜0.05

成分 組別十二指腸K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）空腸K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）回腸K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）結(jié)腸K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 配伍組2.39±0.57 1.98±0.36 1.77±0.38 1.66±0.68 2.02±0.37 2.12±1.07 2.03±0.53 2.54±0.45遠(yuǎn)志組 2.84±0.72 2.56±0.73 3.73±1.77**3.27±1.39* 3.37±1.16* 3.14±1.05 4.13±1.73* 4.21±1.57*遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ 配伍組 4.17±0.67 3.76±1.19 4.19±1.75 3.74±1.24 3.68±0.65 4.27±1.20 3.50±0.79 3.37±1.08遠(yuǎn)志組 5.73±1.79 5.18±1.30 4.31±2.03 4.09±1.64 4.20±1.20 4.28±1.11 4.35±1.72 4.27±1.74和厚樸酚 配伍組 3.33±1.32 2.81±1.06 3.20±0.81 3.11±0.73 2.48±0.48 2.37±0.52 3.86±1.79 4.00±1.66厚樸組 2.76±0.96 2.41±0.80 2.62±0.68 2.47±0.77 2.42±0.35 2.19±0.36 3.57±1.16 3.40±1.45厚樸酚 配伍組 3.67±1.37 3.10±1.10 3.29±0.96 3.31±0.80 2.81±0.51 2.70±0.59 4.27±1.74 4.11±0.82#厚樸組2.91±0.96 2.61±0.89 2.81±0.80 2.74±0.85 2.42±0.44 2.26±0.61 3.62±1.34 3.37±1.09

2.8 P-gp抑制劑對(duì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚、厚樸酚腸吸收的影響 取SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只，取 “2.1.3”項(xiàng)配伍供試液和 “2.1.4”項(xiàng)下供試液，選取回腸段，按 “2.4”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 添加P-gp抑制劑 （鹽酸維拉帕米）后細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚 （HN）及厚樸酚 （MN）吸收的Ka、Papp值 （n=6，）Tab.4 Kaand Pappof TF，PT，HN and MN with verapam il hydroch loride（n=6，）

表4 添加P-gp抑制劑 （鹽酸維拉帕米）后細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚 （HN）及厚樸酚 （MN）吸收的Ka、Papp值 （n=6，）Tab.4 Kaand Pappof TF，PT，HN and MN with verapam il hydroch loride（n=6，）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

成分空白組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）低濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）中濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）高濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 2.02±0.37 2.12±1.07 4.88±0.48**4.09±0.10** 4.99±0.47**4.17±0.34** 5.33±0.75** 4.41±0.37**遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ 3.68±0.65 4.27±1.20 6.01±1.01*5.06±0.34 6.16±1.70*5.11±0.05 7.97±1.51* 7.26±1.91*和厚樸酚 2.48±0.48 2.37±0.52 3.22±0.44*3.18±0.55 3.36±0.29**2.69±0.83 3.34±0.43** 2.94±0.28厚樸酚 2.81±0.51 2.70±0.59 3.42±0.10 2.99±0.18 3.61±0.39*3.06±0.80 3.62±0.52*3.11±0.08

結(jié)果顯示，添加抑制劑后細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ的Ka值均顯著高于空白組 （P＜0.05，P＜0.01），均呈劑量依賴性。

2.9 MRP2抑制劑對(duì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚及厚樸酚腸吸收的影響 取SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只，取 “2.1.3”項(xiàng)配伍供試液和 “2.1.5”項(xiàng)供試液，選取空腸段按 “2.4”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，添加抑制劑后，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的Ka、Papp值均極顯著高于空白組，呈劑量依賴性，且高濃度組極顯著地高于低、中濃度組 （P＜0.01）。中、高濃度組中遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ的Ka值極顯著高于空白組，也有劑量依賴性，且高濃度組顯著高于低濃度組 （P＜0.05）；抑制劑組的Papp值極顯著高于空白組 （P＜0.01），且低濃度組極顯著低于高濃度組 （P＜0.01）。抑制劑各組中和厚樸酚及厚樸酚的Ka、Papp值與空白組比較均無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）。推測(cè)，遠(yuǎn)志厚樸配伍后，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ可能均是MRP2的底物，和厚樸酚及厚樸酚可能均不是MRP2的底物。

表5 添加M RP2抑制劑 （吲哚美辛）后細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚 （HN）及厚樸酚 （M N）吸收的Ka、P app值（n=6，）Tab.5 Kaand P app of TF，PT，HN and MN w ith indometacin（n=6，）

表5 添加M RP2抑制劑 （吲哚美辛）后細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 （TF）、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ （PT）、和厚樸酚 （HN）及厚樸酚 （M N）吸收的Ka、P app值（n=6，）Tab.5 Kaand P app of TF，PT，HN and MN w ith indometacin（n=6，）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高質(zhì)量濃度組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

成分空白組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）低質(zhì)量濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）中質(zhì)量濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）高質(zhì)量濃度組K a/（10-2min-1）P app/（10-3cm·min-1）細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷 1.77±0.38 1.66±0.68 4.83±0.97**△△4.68±0.71**△△5.09±0.68**△△4.90±0.23**△△ 7.45±0.55** 6.91±0.55**遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ 4.19±1.75 3.74±1.24 6.93±3.52△ 7.55±0.91**△△10.77±2.56** 10.36±0.88** 11.93±2.73** 12.15±1.64**和厚樸酚 3.20±0.81 3.11±0.73 3.24±0.44 4.10±0.88 3.37±1.75 4.13±0.81 4.83±1.64 4.27±1.45厚樸酚3.29±0.96 3.31±0.80 3.36±0.49 4.03±0.11 3.37±1.82 4.06±0.92 5.37±2.17 4.38±1.45

3 討論

3.1 色譜條件及K-R液 由細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、和厚樸酚及厚樸酚的3D光譜圖可知，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為末端吸收，參考文獻(xiàn) ［8］故選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在360、320、254、240 nm均有較大吸收，而254 nm為最大吸收波長(zhǎng)；和厚樸酚在294 nm、258 nm和206 nm均有較大吸收，雖206 nm為最大吸收波長(zhǎng)，但此波長(zhǎng)干擾較多不易分離且為末端吸收，故選擇干擾最小的294 nm；厚樸酚在294 nm和218 nm處均有較大吸收，但218 nm干擾較多，故選擇294 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。文獻(xiàn)［9］報(bào)道K-R液加入CaC12十分渾濁，且有沉淀，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)配制時(shí)加入CaC12并邊攪拌邊加入，故克服了渾濁和沉淀現(xiàn)象。

3.2 助溶劑選擇 厚樸中酚類(lèi)物質(zhì) （和厚樸酚、厚樸酚）在K-R液中溶解度很小，需要加助溶劑使之溶解，常用的助溶劑主要有吐溫-80、SDS及泊洛薩姆（Poloxamer）等，預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了1%、2%、5%吐溫-80和0.1%、0.2%、0.5%SDS對(duì)遠(yuǎn)志厚樸各目標(biāo)成分的溶解性，結(jié)果1%、2%吐溫-80和0.1%、0.2%SDS均不能完全溶解酚類(lèi)物質(zhì)，5%吐溫-80和0.5%SDS均能完全溶解。選5%吐溫-80和0.5%SDS對(duì)遠(yuǎn)志厚樸進(jìn)行考察，結(jié)果0.5%SDS對(duì)腸吸收沒(méi)有顯著影響，而5%吐溫-80對(duì)小腸吸收均有顯著促進(jìn)作用 （P＜0.05），與文獻(xiàn) ［10］報(bào)道吐溫-80可能是P-gp抑制劑相符，參考文獻(xiàn) ［11-12］選擇0.5%SDS作為助溶劑。

3.3 腸段選擇 MacLean C等［13］研究表明P-gp在大鼠腸段的表達(dá)依次為結(jié)腸＞回腸＞空腸＞十二指腸?？紤]到雖然P-gp在結(jié)腸表達(dá)最高，但結(jié)腸內(nèi)存在的大量微生物及水解酶可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成誤差，所以本研究選擇在遠(yuǎn)端回腸段。Johnson等［14］研究表明，MRP2表達(dá)較高的腸段是空腸，故本研究選擇空腸段。

3.4 抑制劑與底物 遠(yuǎn)志厚樸配伍后，遠(yuǎn)志能增加厚樸中和厚樸酚、厚樸酚的腸吸收，在配伍組中加入P-gp抑制劑后，抑制劑各濃度組中和厚樸酚、厚樸酚的腸吸收顯著高于空白組，但前期實(shí)驗(yàn)顯示單味厚樸中加入P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米后，和厚樸酚腸吸收有增加趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，可以推測(cè)是遠(yuǎn)志和抑制劑二者作用之和使和厚樸酚、厚樸酚的腸吸收出現(xiàn)顯著性差異，因此不能確定和厚樸酚是P-gp的底物；在配伍組中加入MRP2抑制劑后，抑制劑各質(zhì)量濃度組中和厚樸酚、厚樸酚的腸吸收與空白組均無(wú)顯著性差異，可以說(shuō)明和厚樸酚、厚樸酚均不是MRP2的底物。在配伍組中加入P-gp和MRP2抑制劑后，腸吸收顯著增加。推測(cè)二者均是P-gp和MRP2底物。綜合提示，臨床治病時(shí)，若處方以及制劑中含有遠(yuǎn)志厚樸配伍時(shí)，與鹽酸維拉帕米、利血平、奎尼丁、育亨賓、長(zhǎng)春新堿、Valspodar（PSC833）、Zosuguidar（LY-335979）、Tariquidar（XR-9576）等P-gp抑制劑聯(lián)合用藥，或與吲哚美辛、丙磺舒、呋塞米等MRP2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)使藥物的口服生物利用度提高，使治療作用增加的同時(shí)，毒副作用也增加，治療安全窗口變小。因此，厚樸與遠(yuǎn)志配伍使用，為避免皂苷對(duì)胃腸動(dòng)力帶來(lái)的抑制副作用，不宜與P-gp、MRP2抑制劑聯(lián)用。

3.5 遠(yuǎn)志厚樸配伍關(guān)系 基于課題組前期研究［2，15］，遠(yuǎn)志厚樸1：2配伍能在有效緩解遠(yuǎn)志胃腸動(dòng)力抑制的同時(shí)，其安神、祛痰鎮(zhèn)咳功效仍存，故本實(shí)驗(yàn)選擇1：2配比。遠(yuǎn)志中苷類(lèi)成分既是主要藥效成分，又是引起胃腸動(dòng)力障礙的主要成分。本實(shí)驗(yàn)研究遠(yuǎn)志與厚樸配伍前后二者的主要有效成分在十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸的吸收變化情況，結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志和厚樸配伍后，遠(yuǎn)志中的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷腸吸收速率常數(shù) （Ka）在十二指腸有降低趨勢(shì)，在回腸、結(jié)腸、空腸均顯著性降低；表觀吸收系數(shù) （Papp）值在空腸和結(jié)腸有顯著性降低，在十二指腸和回腸段均有降低趨勢(shì)。二者配伍后，厚樸的酚類(lèi)成分腸吸收均有增加趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，厚樸酚在結(jié)腸的Papp值顯著高于回腸。綜上可以說(shuō)明遠(yuǎn)志厚樸配伍后，厚樸能顯著抑制遠(yuǎn)志中苷類(lèi)成分在小腸的吸收；而遠(yuǎn)志能促進(jìn)酚類(lèi)成分吸收。這可能是二者配伍后能緩解胃腸動(dòng)力障礙副作用，發(fā)揮 “減副存效”的機(jī)制之一。中藥配伍原理復(fù)雜，其吸收后的作用機(jī)制尚待深入研究。

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Active elements from Yuanzhiand Houpo，and their intestinal absorption due to the com bined use

HUANG Li-hua， WANG Jian*， WU Ming-quan， ZHU Zhang-pei， GAO Tian-hui， LU Xiao-hua

（College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，The Ministry of Education Key Laboratory for Standardization of Chinese Herbal Medicine，Chengdu 611137，China）

AIMTo explore the intestinal absorption of tenuifolin，onjixanthoneⅢ，honokiol，and magnolol by the combined use of Yuanzhi（Polygalae Radix）and Houpo（Magnoliae officinalis Cortex）.METHODSHPLC-DAD was applied tomeasureing the abovementioned active components contents in one-way intestinal perfusion modelwith corrected perfusate gravimetricmethod.Moreover，the influence to the absorption site，inhibitor，and the effect on permeability glycoprotein（P-gp）and multidrug resistance-associated protein（MRP2）by the combined use of Yuanzhiand Houpowere assessed.RESULTSKaand Pappof tenuifolin on jejunum and colon in combination group was lower than that of Yuanzhi group（P＜0.01，P＜0.05）.Kaand Pappof onjixanthoneⅢin intestinal segments tended to decrease compared to Yuanzhigroup.Kaand Pappof honokiol and magnolol in combination group performed differently compared to Houpo group.Kaof tenuifolin，onjixanthoneⅢ，and honokiol in each group and Kaofmagnolol in middle and high concentrations were significantly higher than these in the blank group（P＜0.05，P＜0.01）adding of Verapamil.Kaand Pappof tenuifolin in groups and onjixanthoneⅢinmiddle and high concentration were significantly higher than these in the blank group（P＜0.01）due to Indometacin，but Kaand Pappofhonokiolandmagnololwere found higher in the trial group.CONCLUSIONHoupu can inhibit the absorption of tenuifolin and onjixanthoneⅢin jejunum and colon，given the efflux of P-gp and MRP2 and possibly the substrates of P-gp and MRP2.Whereas Yuanzhi can improve the absorption of honokiol and magnolol in jejunum and colon，but not because of the substratesof P-gp and MRP2.The combination of Yuanzhiand Houpo mustavoid sharing with P-gp and MRP2 enzyme inhibitor.

Yuanzhi（Polygalae Radix）；Houpo（Magnoliaeofficinalis Cortex）；combination；intestine absorption；one-way intestinal perfusion model in vivo；tenuifolin；onjixanthoneⅢ；honkiolmagnolol；P-gp；MRP2

R969.1

A

1001-1528（2015）04-0739-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.011

2014-09-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81173567）

黃立華 （1986—），男，博士生，從事中藥藥性理論研究。Tel：13880622139，E-mail：378097998@qq.com

*通信作者：王 建 （1959—），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥性理論研究。Tel：（028）61800231，E-mail：jianwang08@ 163.com