龍 穎， 王 巍， 田 慧， 肖喜泉， 王 勤， 唐慧勤*

（1.廣西中醫(yī)藥大學廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西南寧530001；2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣西桂林541002）

羅漢果甜苷含藥血清干擾肝星狀細胞周期、凋亡的實驗研究

龍 穎1，2， 王 巍1， 田 慧1， 肖喜泉1， 王 勤1， 唐慧勤1*

（1.廣西中醫(yī)藥大學廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西南寧530001；2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣西桂林541002）

目的研究羅漢果甜苷含藥血清 （SCM）對大鼠肝星狀細胞 （HSC-T6）合成的細胞外基質、細胞周期及凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)HSC-T6細胞，并以SCM干預，然后測定細胞上清液中Hyp、透明質酸 （HA）和層黏蛋白（LN），同時檢測細胞周期分布及細胞凋亡的變化。結果SCM（5%、10%和20%）細胞上清液中羥脯氨酸 （Hyp）水平顯著降低；SCM（20%、10%）細胞上清液中HA和LN水平減少；SCM各質量濃度組作用48 h后，HSC-T6細胞周期產(chǎn)生明顯變化，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，且正常細胞比例呈劑量依賴性下降。結論羅漢果甜苷對HSC-T6細胞周期具有阻滯作用，能誘導其發(fā)生凋亡，并可抑制膠原生成，促進細胞外基質降解，可能是其抗肝纖維化的部分作用機制。

羅漢果甜苷；肝星狀細胞；凋亡；細胞周期；細胞外基質；肝纖維化

肝纖維化的發(fā)生機制十分復雜，但主要是由于肝細胞外基質的過度增生和降解減少造成，而肝星狀細胞是合成肝細胞外基質的主要細胞，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用［1-3］。羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle.）C. Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang是藥食兩用的廣西省特產(chǎn)中藥，而羅漢果甜苷是其主要成分，對大鼠和小鼠的急慢性肝損傷均有保護作用，其機制可能是通過抑制肝星狀細胞HSC-T6增殖及肝纖維化相關基因［4-8］。本實驗研究了羅漢果甜苷對肝星狀細胞凋亡、細胞周期和細胞外基質的影響，為進一步闡明其抗纖維化作用機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及主要試劑 羅漢果提取物 （桂林萊茵生物科技股份有限公司，批號090201，提取工藝是以超聲波提取得到粗提物，再以膜分離純化得到，質量分數(shù)≥80%）；秋水仙堿片（Colchicine，云南植物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號100807）。DMEM培養(yǎng)液 （美國Gibico公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；Hyp檢測試劑盒（南京建成科技有限公司）；HA、LN檢測試劑盒 （北京北方生物技術研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；細胞周期檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 動物及細胞株 SPF級SD大鼠，體質量120～150 g（廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK［桂］2009-0002）。肝星狀細胞系HSC-T6（為SV40轉染SD大鼠HSC，其表型為活化的HSC。廣西醫(yī)科大學黃仁彬教授）提供。

1.3 儀器 SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公

司）；311型二氧化碳培養(yǎng)箱、Thermo Forma 725超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XD-101倒置顯微鏡（南京江南光電集團股份有限公司）；SS-325高壓滅菌鍋（日本Tomykogo公司）；5415R小型臺式離心機、5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；DFM-96型多管放射免疫計數(shù)器 （合肥眾成機電技術開發(fā)有限責任公司）；722可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；Epics-XLⅡ型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取大鼠42只，隨機分為羅漢果甜苷組、秋水仙堿陽性對照組和空白對照組，每組14只。羅漢果甜苷組每日灌胃給藥400 mg/kg［8］，陽性對照組每日灌胃秋水仙堿0.1 mg/kg，空白對照組每日灌胃生理鹽水10 mL/kg，每天給藥2次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后1 h各組大鼠腹主動脈取血，4 000 r/min離心15 m in，合并同組大鼠血清，56℃下滅活30 min，0.22μm微孔濾膜濾過除菌，-20℃冰箱保存。羅漢果甜苷組血清中加入對照組血清，分別以1∶0、1∶1、1∶3比例稀釋，進行預實驗，結果發(fā)現(xiàn)1∶3稀釋的含藥血清對HSC-T6細胞增殖有顯著抑制作用。然后，以不影響細胞生長的最大血清體積分數(shù)（20%）為羅漢果甜苷含藥血清最大給藥劑量，設置含藥血清體積分數(shù)5%、10%、20%這3個梯度，均加入對照組血清稀釋至相應體積分數(shù)。HSC-T6細胞培養(yǎng)體系中各組大鼠血清終體積分數(shù)為20%。

2.2 消化法和RIA法檢測HSC-T6的細胞外基質 將肝星狀細胞系HSC-T6接種于24孔板 （密度1×105個/mL），培養(yǎng)12 h后，換成含20%空白大鼠血清的培養(yǎng)液，分別設置羅漢果甜苷含藥血清5%、10%、20%組、秋水仙堿含藥血清20%組和空白對照血清20% （正常大鼠血清體積與其和培養(yǎng)液總體積的百分比值）組，每組設4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，消化法檢測其中羥脯氨酸（Hyp）水平，RIA法檢測細胞上清液中透明質酸（HA）和層黏蛋白 （LN）水平。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 將HSC-T6細胞接種于5個50 mL培養(yǎng)瓶中 （密度1×105個/mL），培養(yǎng)24 h后，換成含20%空白大鼠血清的培養(yǎng)液，分組與給藥方法同“2.2”項。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后胰酶消化，離心沉淀細胞，轉移至1.5mL離心管內(nèi)，70%乙醇在4℃下固定12 h，碘化丙啶染色，37℃下避光溫浴30 min，流式細胞儀在488 nm波長處檢測紅色熒光和光散射情況。每份標本約測定10 000個細胞，測定速率為每秒50～60個細胞，MultiCycle AV軟件進行細胞周期分析，以計算各期細胞百分率。

2.4 Annex V-FITC和PI雙染法檢測細胞凋亡 將HSC-T6細胞接種于5個50 mL培養(yǎng)瓶中 （密度1×105個/mL），培養(yǎng)24 h后，換成含20%空白大鼠血清的培養(yǎng)液，分組與給藥方法同 “2.2”項。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后胰酶消化，離心沉淀細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，1×Binding Buffer懸浮，加入1μL Annexin V-FITC，混勻后再加入5 μLPI，避光室溫下反應5min，流式細胞儀檢測（Ex=488 nm，Em=530 nm）細胞凋亡情況，綠色熒光FITC通道檢測Annexin V-FITC，紅色熒光通道檢測PI。每份標本測定10 000個細胞，測定速率為每秒50～60個細胞。

2.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞上清液中Hyp、HA和LN的影響 隨著濃度增加，細胞上清液中Hyp含有量呈遞減趨勢，羅漢果甜苷血清各濃度組中Hyp含有量與空白對照（NS）組比較，有顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞上清液中Hyp、HA和LN的影響(x±s,n=4)

3.2 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞周期的影響 經(jīng)5%、10%和20%羅漢果甜苷血清作用于肝星狀細胞HSC-T6 48 h后，細胞周期分布開始有明顯變化，G2/M期細胞數(shù)量減少。其中，羅漢果甜苷血清5%和10%組中的細胞主要被阻滯于G0/G1期及S期，而20%組中的細胞被大量阻滯于G0/G1期，與空白對照組比較，10%和20%組均有顯著性差異 （P＜0.01）。由此可見，隨著藥物濃度的增大，細胞被阻滯于G0/G1期的現(xiàn)象越明顯，而在低濃度下時，可將其阻滯于G0/G1及S期，見圖1和表2。

圖1 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞周期的影響

表2 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞周期的影響(x±s, n=5)

3.3 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞凋亡的影響 HSC-T6中空白對照組的細胞大多分布于流式圖的第三象限，即為正?；罴毎?。隨著體積分數(shù)增高，HSC-T6凋亡率呈劑量依賴性增加，與空白對照組比較，均有顯著性差異 （P＜0.01），表明羅漢果甜苷血清對HSC-T6有明顯的促凋亡作用，見表3和圖2。

表3 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞周期的影響(x±s,n=5)

圖2 羅漢果甜苷血清對HSC-T6細胞周期的影響

4 討論

多數(shù)研究表明，間質細胞，尤其是肝星狀細胞 （HSC）在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9-10］，因此誘導活化的HSC凋亡是抗纖維化治療的有效手段［2］。本實驗利用流式細胞儀，以磷脂酰絲氨酸外翻分析法（annexin V/PI）來檢測羅漢果甜苷血清作用48 h后對HSC-T6細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，各藥物濃度組均存在顯著性差異 （P＜0.01），并隨著藥物濃度上升，細胞凋亡數(shù)量也隨之增加，顯示一定的量效關系。由此證明，羅漢果甜苷可有效地促進HSC-T6凋亡，這可能是其抗肝纖維化機制之一。另外，還應用了流式細胞術對細胞周期進行分析，結果發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷血清作用48 h后對其產(chǎn)生影響。低劑量羅漢果甜苷血清可將細胞周期抑制在G0/G1期及S期，而隨著藥物濃度增大，G0/G1期細胞堆積程度越明顯，與空白對照組比較，各濃度的羅漢果甜苷血清對細胞周期的影響均存在顯著性差異 （P＜0.01）。同時，高濃度羅漢果甜苷血清作用于HSC-T6后，G0/G1期細胞比例增加了約25%，說明它可將細胞周期抑制在G0/G1期，其阻滯機制尚有待進一步研究。

細胞外基質主要由膠原 （如Hyp）、非膠原蛋白 （如LN）、蛋白多糖 （如HA）三類成分組成，在肝纖維化過程中，三者可參與肝血竇基底膜形成，致使肝竇毛細血管化。正常情況下，肝細胞可直接與肝血竇接觸，但一旦肝竇毛細血管化，可妨礙肝細胞與血竇間營養(yǎng)物質的交換，引起肝細胞發(fā)生缺血、缺氧、變性壞死，導致其功能障礙。各種致病因子 （如肝炎病毒、化學物質等）都能激活肝組織中多種細胞因子生成，并可刺激肝星形細胞增殖及活化，使膠原合成增加［2］。在前期研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷對CCl4所致的大鼠和小鼠急性肝損傷有保護作用，說明其可減少CCl4對肝星形細胞的刺激［6-7］，而本實驗也證實它能降低HSC-T6細胞上清液中Hyp、HA、LN水平，對細胞外基質有顯著抑制作用，體內(nèi)和體外實驗結果一致。另外，前期研究還發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷血清對HSC-T6中Col-I、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達均有顯著抑制作用［7］。由此推測，羅漢果甜苷可能是通過抑制HSC-T6中Col-I、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達來抑制膠原生成，促進細胞外基質降解，從而達到逆轉肝纖維化的目的。

本實驗結合前期研究成果表明，羅漢果甜苷在體內(nèi)和體外均有抑制肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，可能成為一種潛力很大的治療肝纖維化藥物。

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R966.1

：B

：1001-1528（2015）07-1576-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.041

2014-10-12

國家自然科學基金項目 （81160518）；廣西自然科學基金項目 （2012GXNSFBA053088）；廣西教育廳科研課題項目（20120220054）

龍 穎 （1977—），女，碩士，主管中藥師，從事醫(yī)院藥學工作。Tel：（0773）2821921，E-mail：286723679@qq.com

*通信作者：唐慧勤 （1979—），女，碩士，講師，從事藥理學和中藥藥理學研究。Tel：（0771）2279423，E-mail：478839447@qq.com