王成蹊， 周 靜， 秦 飛， 王 嫻， 侯連兵*

（1.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院藥學部，廣東廣州510515）

[科研報道]

維通靜脈注射乳劑對大鼠實驗性腸粘連的防治作用研究

王成蹊1， 周 靜2， 秦 飛3， 王 嫻3， 侯連兵3*

（1.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院藥學部，廣東廣州510515）

目的研究維通靜脈注射乳劑對術(shù)后腹腔粘連防治作用及對組織型纖溶酶原激活物 （tPA）、纖溶酶原活化抑制因子 （PAI-1）和環(huán)氧化酶2（COX-2）的影響。方法給實驗性術(shù)后腸粘連模型大鼠靜脈注射不同劑量的維通靜脈注射乳劑及地塞米松，模型組注射生理鹽水，7 d后開腹，分別進行粘連程度分級評價。然后取血，ELISA法測定血漿中tPA及PAI-1蛋白水平，實時熒光定量PCR（QPCR）法測定腹壁損傷部位組織tPA、PAI、COX-2 mRNA表達水平。結(jié)果維通靜脈注射乳劑可以顯著降低大鼠術(shù)后粘連發(fā)病程度，提高血漿內(nèi)tPA蛋白水平，增強損傷部位tPA mRNA表達，同時降低COX-2 mRNA表達水平。結(jié)論維通靜脈注射乳可以有效地防治術(shù)后腸粘連。

維通靜脈注射乳劑；術(shù)后腸粘連；組織型纖溶酶原激活物；纖溶酶原活化抑制因子；環(huán)氧化酶2

腹腔粘連常發(fā)生于手術(shù)、腹部創(chuàng)傷、甚至自發(fā)形成。其中，以術(shù)后腹腔粘連較為常見［1］，由于它大多表現(xiàn)為腸道相互粘連或腸道與腹壁粘連，因此也常稱為術(shù)后腸粘連［2］。維通靜脈注射乳劑 （WIE）是由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院最新研制的用于防治術(shù)后腸粘連的靜脈注射用亞微乳制劑，為了明確其療效，探討其預防術(shù)后腸粘連的作用機理，并為臨床研究提供實驗依據(jù)，本實驗制作了大鼠實驗性腸粘連模型［3］，給藥后觀察其腹腔粘連程度，并測定血漿中組織型纖溶酶原激活物 （tPA）及抑制因子（PAI-1）的變化情況，探討維通靜脈注射乳劑對術(shù)后腸粘連的影響。

1 材料與儀器

維通靜脈注射乳劑由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院藥學部制備，由丹參、大黃等中藥提取物組成，采用高壓勻質(zhì)法制成靜脈注射用亞微乳制劑［4-5］，總質(zhì)量濃度為0.22 mg/mL，使用丹參酮ⅡA為質(zhì)量控制指標，每1 m L維通靜脈注射乳劑中含丹參酮IIA 0.02 mg（批號20130416）；Wistar雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g（南方醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號scxk粵2011-0015）；地塞米松注射液 （成都天臺山制藥有限公司，批號20120507）。

tPA、PAI酶聯(lián)免疫試劑盒（美國Cell Sciences公司，批號CSI11924A、CSI19919A）；PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（日本TAKARA公司，批號分別為D90108A、DRR081A）；Agilent Stratagene 3005PTM system型PCR擴增儀（美國安捷倫公司）；多功能酶標儀 （美國MDS公司）。

2 方法

2.1 大鼠實驗性術(shù)后腸粘連模型制備［3］實驗前12 h所有動物禁食不禁水，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，腹部脫毛，經(jīng)2%碘酊和75%乙醇消毒皮膚，鋪上無菌巾，取下腹部正中切口約2 cm，取出盲腸，置于無菌紗布上約5 min，使?jié){膜干燥，以解剖刀片輕刮整個盲腸漿膜10遍，造成輕度滲血，再滴1滴無水乙醇于創(chuàng)面上，然后以無齒鑷夾住盲腸系膜動脈約2min，造成暫時局部缺血。盲腸回納入腹腔原位后，以止血鉗夾傷相應腹壁，分兩層以1～0號絲線關(guān)閉腹腔，即得腸粘連模型。

2.2 實驗分組及給藥 Wistar大鼠50只按體質(zhì)量隨機分組，并制作腹腔粘連模型，共分5組，每組分別10只：設置模型組、陽性對照地塞米松組、維通靜脈注射乳劑高、中、低劑量組。模型組每日尾靜脈注射生理鹽水1 mL/kg，陽性對照組每日注射地塞米松3 mg/kg，高、中、低劑量組分別注射含丹參酮ⅡA（質(zhì)量控制指標）3、1.73、1 mg/kg的維通靜脈注射乳劑［6］。各組大鼠分籠飼養(yǎng)7 d，自由進食和飲水。

2.3 粘連程度評級 各組大鼠于術(shù)后第7天給藥后3 h，戊巴比妥麻醉，開腹。采用Nair［7］分級標準，對粘連程度進行分級評分。0級為無粘連；1級為內(nèi)臟和腹腔壁或內(nèi)臟間出現(xiàn)1條粘連帶；2級為內(nèi)臟和腹腔壁或內(nèi)臟間出現(xiàn)兩條粘連帶；3級為內(nèi)臟出現(xiàn)多于兩條粘連帶，或者內(nèi)臟間形成團塊但未與腹腔壁粘連；4級為內(nèi)臟直接粘連至腹腔壁，而不論粘連帶多少。

2.4 血漿tPA和PAI含有量測定 從腹主動脈采血3 mL至抗凝管，3 000 r/min離心20 min，分離血漿，參照ELISA試劑盒說明書操作，測定樣本OD值，繪制標準曲線，換算tPA和PAI含有量。

2.5 QPCR檢測tPA、PAI、COX-2mRNA含有量 剪取損傷部位腹壁組織（0.5 cm×0.5 cm），研碎組織，Trizol試劑提取總RNA，用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA用SYBR ?Premix Ex TaqTMⅡ進行PCR反應，反應體系（總體積20 μL）配制方法為SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.8μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板2.0μL（總量100 ng），無RNase滅菌蒸餾水6.0μL。反應條件設置為95℃30 s預變性；95℃3 s、59℃30 s退火 （40個循環(huán)）；反應使用引物由TaKaRa公司設計并合成，以β-actin為內(nèi)參引物，引物序列β-actin正向5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′反向5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；TPA正向5′-CGCTGTACCTCACAGCATCTGTTTA-3′反向5′-CATCCGCTTATCGATCATGCAC-3′；PAI-1正向5′-ACCATCTCCGTGCCCATGA-3′反向5′-GGGCAGTTCCAGGATGTCGTA-3′，COX-2正向5′-AACACGGACTTGCTCACTTTGTTG-3′反向5′-AATGGAGGCCTTTGCCACTG-3′，所得結(jié)果應用2-ΔΔCT方法［8］分析目的基因的相對表達量。

2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。結(jié)果用均數(shù)±標準差 （x±s）表示，大鼠各組粘連評級比較采用Kruskal-Walli Test秩和檢驗，完全隨機設計資料的多個樣本均數(shù)比較采用One-Way ANOVA檢驗。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腹腔粘連程度分級情況 腹部手術(shù)后第7天，各組動物均存活，其腸粘連程度分級比較情況見表1。由表可知，模型組動物均發(fā)生不同程度的粘連，有的粘連帶厚實難以剝離，粘連程度明顯高于其他組 （P＜0.05）。高劑量組與地塞米松組大鼠粘連帶窄，呈薄膜狀，甚至無粘連，粘連程度顯著低于模型組 （P＜0.05）。

表1 各組大鼠腹腔粘連程度分級情況

3.2 維通靜脈注射乳劑對大鼠血漿tPA、PAI-1水平影響

測定結(jié)果表明，維通靜脈注射乳劑能顯著升高tPA水平，其中高劑量組明顯高于其他組 （P＜0.05）；給藥各組間PAI-1水平無顯著性差異，但均顯著高于模型組 （P＜0.05），見表2。

表2 不同給藥組對大鼠血漿tPA、PAI-1水平的影響(n=10,x±s)

3.3 QPCR檢測各組tPA、PAI、COX-2 mRNA表達水平

與模型組相比，tPA mRNA相對表達量各組均顯著升高（P＜0.05），高劑量WIE組和地塞米松組mRNA表達水平顯著高于其他組 （P＜0.05），地塞米松組與中、低劑量WIE組mRNA表達水平有顯著性差異（P＜0.05）；給藥各組間PAI-1mRNA表達水平無顯著性差異，但均顯著高于模型組（P＜0.05）；COX-2mRNA相對表達量各組相對模型組均顯著降低 （P＜0.05），高劑量WIE組和地塞米松組mRNA表達水平顯著低于他各組 （P＜0.05），見表3。

表3 不同組tPA、PA Im RNA相對表達水平(n=10, x±s)

4 討論

粘連形成的病理學原因十分復雜，纖溶系統(tǒng)激活過程中纖溶酶原激活后產(chǎn)生纖維蛋白酶的作用是抑制其形成的主要影響因素之一［9］。在手術(shù)時，無論是創(chuàng)傷、磨損還是感染，都會導致纖維蛋白與纖溶系統(tǒng)之間失衡，從而弱化纖溶蛋白的活性，最終形成粘連。纖溶酶原是纖溶酶的前體物質(zhì)，而纖溶酶能夠高效地降解纖維蛋白并在組織修復中扮演多重角色。激活纖溶酶原的主要物質(zhì)是tPA，由內(nèi)皮細胞、間皮細胞和巨噬細胞分泌所得。在纖溶系統(tǒng)中，未激活的纖溶酶原在tPA的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)的纖溶酶，而這一過程可以被PAI-1所抑制［9］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，降低tPA活性或提高PAI-1表達數(shù)量會導致更為嚴重的粘連現(xiàn)象［10］。目前，多種藥物已被證明可以通過提高tPA的活性來增強腹膜內(nèi)纖溶系統(tǒng)活性，從而防止粘連形成，如他丁類藥物、奧曲肽、亞甲藍等［11-13］。

維通靜脈注射乳劑的主要成分來自于丹參、大黃等中藥的提取物，通過對有效組分的篩選和制劑學研究，進一步形成靜脈乳注射劑。實驗表明，地塞米松組和維通不同劑量組粘連程度同模型組比較均有顯著改善 （P＜0.05），維通靜脈注射乳劑高劑量組與地塞米松組大鼠的粘連程度相似，無顯著性差異 （P=0.853）。進一步研究它對纖溶系統(tǒng)的影響時發(fā)現(xiàn)，維通各組tPA水平均顯著高于模型組，高、中劑量維通靜脈注射乳劑顯著高于地塞米松組，而低劑量維通靜脈注射乳劑的tPA水平與地塞米松無顯著差異。同時，維通靜脈注射乳劑可以有效提高腹壁損傷部位組織tPA的mRNA表達水平，說明它可以增強tPA分泌，增加纖溶蛋白酶原向纖溶蛋白的轉(zhuǎn)換，促進對纖維蛋白的溶解，從而有效阻止粘連條帶的形成。另外，地塞米松組和維通不同劑量組之間的血漿PAI-1蛋白水平以及腹壁損傷部位PAI的mRNA表達水平均無顯著差異，說明各給藥組對PAI-1的影響相當，但與同模型組比較，這些組的PAI-1水平均顯著升高，產(chǎn)生該結(jié)果的機制目前仍不清楚，有待進一步研究。

COX-2是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，主要存在于核膜和微粒體膜，是炎癥過程中一個重要的誘導酶，同時也是治療炎癥的一個重要的靶分子［14］。一般當細胞處于靜息期時，不易檢測到COX-2水平，當細胞接受相應刺激后便開始合成，一般需數(shù)小時至十幾小時。研究發(fā)現(xiàn)，使用抗炎藥保泰、吲哚美辛等可以有效治療術(shù)后粘連［15-16］，Maghsoudi等［17］報道，使用選擇性COX-2抗炎藥吡羅昔康也可以抑制其形成，說明抗炎藥物無論是選擇性還是非選擇性COX-2抑制劑，對術(shù)后粘連都會產(chǎn)生抑制作用。本實驗對創(chuàng)傷部位的COX-2基因水平研究反向，在給予維通靜脈注射乳劑后，與同模型組比較，創(chuàng)傷部位的COX-2mRNA水平會顯著下降，說明維通靜脈注射乳劑對粘連形成部位的炎癥反應有抑制作用，可能是其抗粘連作用的機制之一。

綜上所述，本實驗證明維通靜脈注射乳劑可有效防治術(shù)后腹腔粘連的形成，為將其應用于臨床打下了基礎。但由于術(shù)后腹腔粘連機制涉及到多個因素，而本實驗對其只是進行了初步探索，因此，進一步從分子藥理學角度研究維通靜脈注射乳劑對粘連細胞的影響并闡明藥物作用的機理是下一階段研究的目標。

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：1001-1528（2015）07-1562-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.036

2014-09-16

王成蹊 （1977—），男，博士，講師，從事新藥研究與開發(fā)。Tel：（020）39352529，E-mail：278012637@qq.com

*通信作者：侯連兵 （1957—），男，教授，主任藥師，博士生導師，從事新藥研究與開發(fā)。Tel：（020）61642175，E-mail：smuhlianbing@hotmail.com