孫蓉蓉，鄒 玲，劉文華，張 燦，李文立，任慧英

(青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109)

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水貂大腸桿菌的分離·鑒定及藥敏試驗

孫蓉蓉，鄒 玲，劉文華，張 燦，李文立，任慧英*

(青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109)

[目的]為更好預防水貂大腸桿菌病提供依據(jù)。[方法]從山東某大型水貂養(yǎng)殖場采集病料，通過病原分離、培養(yǎng)特性、染色特性和生化試驗等對病原進行分離與鑒定，并對分離菌進行藥敏試驗。[結果] 共分離致病菌18株，其中有10株為大腸桿菌，說明該養(yǎng)殖場主要的細菌病為大腸桿菌感染。藥敏試驗結果表明分離出的大腸桿菌對大多數(shù)抗菌藥物敏感。[結論] 水貂發(fā)生細菌病后，應盡可能通過藥敏試驗篩選敏感藥物，避免盲目投藥。

水貂；大腸桿菌；分離；鑒定；藥敏試驗

水貂大腸桿菌病是水貂的一種腸道傳染病，常呈敗血型經(jīng)過，伴有嚴重下痢，侵害呼吸器官，死亡率高[1]。自20世紀80年代以來，山東省水貂養(yǎng)殖場數(shù)量逐年增加。據(jù)海關貿易總署統(tǒng)計，全國平均年產(chǎn)水貂皮1 200萬張，其中山東省占2/3。養(yǎng)殖水貂利潤很高，是農(nóng)民脫貧致富的有效途徑，深受農(nóng)民的歡迎[2]。由于養(yǎng)殖水貂的規(guī)模不斷擴大，水貂抗病力逐年降低。條件性致病菌是繼發(fā)水貂細菌病的主要病原，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，也制約了水貂養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。

近年來，科研工作者對水貂病毒性疾病的研究較為深入，并且已經(jīng)得到一定控制，而對水貂細菌性疾病的相關報道則很少。筆者通過對山東省威海市某大型養(yǎng)殖場的病料采集，分離并鑒定了10株水貂大腸桿菌，并對分離菌株進行了藥敏試驗，以期為更好地預防水貂大腸桿菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源病料采自山東省威海市某水貂養(yǎng)殖場新鮮病死水貂。

1.2 主要試劑普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂(TSI)，均購自北京路橋技術有限公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基為青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品；葡萄糖蛋白胨水、糖發(fā)酵管、西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離無菌取病死水貂的肝臟，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況及菌落特征。

1.4 細菌的純化及形態(tài)觀察取初步分離的細菌，劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基及大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫純化培養(yǎng)24 h，挑選典型菌落在新鮮斜面上進行純培養(yǎng)。挑取1環(huán)細菌的純培養(yǎng)產(chǎn)物，按照常規(guī)方法進行革蘭氏染色鏡檢。

1.5 生化鑒定

1.5.1糖類代謝試驗。 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的典型菌落，接種微量糖發(fā)酵管、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結果。

1.5.2其他生化反應。 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的典型菌落，按照常規(guī)方法進行吲哚試驗、MR試驗、VP試驗及檸檬酸鹽利用試驗(合稱IMViC試驗)[3]。

1.6 紙片擴散法藥敏試驗將濃度為108CFU/ml的新鮮菌液涂布普通營養(yǎng)瓊脂平板，放置5 min后將18種藥敏紙片貼于平板表面，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h后觀察結果，按照CLSL標準進行藥物敏感性評價[4]。

2 結果與分析

2.1 細菌培養(yǎng)結果從28份病料共分離出18株細菌。分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落；其中，10株分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上形成桃紅色、光滑、中等大小的菌落。在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上形成藍綠色菌落。

2.2 形態(tài)及生化鑒定將各分離菌進行革蘭氏染色并鏡檢，可見淡紅色、短小的桿狀細菌。各分離菌均可以分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，60%的菌株還利用蔗糖；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上斜面和底層均產(chǎn)酸，變黃，產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫；IMViC試驗結果為“+ + - -”。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》可知，上述分離菌均符合大腸桿菌的特性[5]，因此可以確定其為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗結果根據(jù)CLSI標準可知，10株大腸桿菌對不同藥物的藥敏紙片的抑菌情況如表1。從表1可以看出，10株水貂大腸桿菌分離株對18種抗生素均有不同程度耐藥，其中環(huán)丙沙星、諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、氨芐西林5種抗菌藥的耐藥性都大于50%，而對頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟的耐藥率為0。10株大腸桿菌分離株對18種抗生素的敏感性也有所不同，以頭孢西叮、頭孢他啶、頭孢吡肟敏感率最高，達到100%。除1株大腸桿菌僅對四環(huán)素耐藥(1耐)外，其他均為多耐菌株，其中2個2耐菌株，1個3耐菌株，1個4耐菌株，2個7耐菌株，1個9耐菌株，2個菌株同時對13種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥。

表1 藥敏試驗結果

抗菌藥物敏感菌株數(shù)百分比∥%中介菌株數(shù)百分比∥%耐藥菌株數(shù)百分比∥%頭孢噻吩77000330頭孢唑啉77000330頭孢呋辛77000330頭孢哌酮77033000頭孢噻肟660110330頭孢西叮101000000頭孢曲松77000330頭孢他啶101000000頭孢吡肟101000000環(huán)丙沙星55000550諾氟沙星55000550左氧沙星66000440阿米卡星440440220鏈霉素110110880磷霉素88000220氯霉素440110440四環(huán)素11000990氨芐西林440110550

3 討論

筆者對某大型養(yǎng)貂場進行了為期3個月的病料采集，共收集28次(份)病料，經(jīng)實驗室分離與鑒定，共獲得10株大腸桿菌，分離率為35.7%，說明大腸桿菌是該養(yǎng)貂場的主要細菌病原，這與文獻中的大腸桿菌病是水貂常發(fā)病的報道一致[6-8]。大多數(shù)大腸桿菌是人類和動物腸道中的共棲菌，但當細菌發(fā)生移位，入侵腸外組織，即成為條件性致病菌，另外，還有某些血清型的大腸桿菌是人類和動物的重要致病菌[9]。水貂大腸桿菌病的發(fā)病與飼養(yǎng)場內的飼養(yǎng)管理、飼料、環(huán)境衛(wèi)生和氣候變化等有密切的關系，因此，臨床防治大腸桿菌病，水貂場應嚴格控制飼養(yǎng)管理，不能混群飼養(yǎng)，同時要嚴格管理飼養(yǎng)衛(wèi)生，增強消毒意識，做到定期消毒, 減少環(huán)境中致病菌的含量，從而有效減少致病菌對水貂的侵害，氣候劇變時可以適當使用藥物預防。飼喂安全的飼料可以有效減少水貂大腸桿菌病的發(fā)生。對來源不明的動物性飼料，必須經(jīng)高溫加工后方可飼喂[10]。

此次分離的10株水貂大腸桿菌對頭孢西叮、頭孢他啶和頭孢吡肟3種抗菌藥物的敏感率為100%，對其他15種抗菌藥物則表現(xiàn)為不同程度的耐藥，有2株大腸桿菌可對13種藥物同時耐藥。多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)與水貂細菌病防治中濫用抗菌藥物有很大關系，許多養(yǎng)殖戶不按照劑量及療程給藥治療，或在飼料及飲水中長期添加抗菌藥物進行疾病預防，都會造成耐藥性提高。藥敏試驗結果表明，水貂發(fā)生細菌病后應盡可能通過藥敏試驗篩選敏感藥物，避免盲目投藥。

[1] 趙純德，應禎灝，王林志，等.舟山市三起水貂大腸桿菌病的診治報告[J].毛皮動物飼養(yǎng),1989(4):22-24.

[2] 馬利. 水貂養(yǎng)殖商機巨大[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)，2002(5)：27-28.

[3] 胡桂學.獸醫(yī)微生物學實驗教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2006:47-60.

[4] 楊沙沙,王喜仁,韓杰，等.美國CLSI抗菌藥物敏感試驗操作標準(2010年版)部分變更內容[J].中國感染控制雜志,2010(4):303-304.

[5] R E 布坎南.伯杰氏細菌鑒定手冊[K].北京：科學出版社，1984.

[6] 曹榮峰,田洪宇,王繼芳，等.水貂細菌性疾病的病原學調查[J].經(jīng)濟動物學報,2008,12(1):21-23.

[7] 張貴賢,史秋梅.水貂大腸桿菌病的診斷與防治[J].中國獸醫(yī)雜志,2013,49(2):45-46.

[8] 邢蘭君.水貂大腸桿菌病的診斷與治療[J].獸藥與飼料添加劑,2008,13(3):39.

[9] 李一經(jīng). 獸醫(yī)微生物學[M].北京：高等教育出版社,2011.

[10] 倪金花.水貂大腸桿菌病的預防和治療[J].養(yǎng)殖技術顧問,2014(1):170.

Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test ofEscherichiacolifrom Minks

SUN Rong-rong, ZOU Ling, LIU Wen-hua, REN Hui-ying*et al

( College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao, Shandong 266109)

[Objective] The research aimed to provide basis for preventing the colibacillosis of minks. [Method] The diseased samples of minks were collected from a big mink farm in Shandong Province. The pathogens were isolated and identified by pathogen isolation, culture characteristics, staining characteristics and biochemical tests. And the sensitivity test was conducted on the isolated pathogens. [Result] 18 strains of pathogenic bacteria were isolated, including 10 strains ofEscherichiacoli. These results indicated thatE.coliwas the main bacterial pathogen in this farm. The results of that drug sensitivity test showed that the isolated strains ofE.coliwere sensitive to most antimicrobials. [Conclusion] When the bacteriosis of minks occurred, the sensitive drugs should be selected by drug sensitivity test to avoid drug abuse.

Mink;Escherichiacoli; Isolation; Identification; Drug sensitivity test

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系毛皮動物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-18-011-04)。

孫蓉蓉(1991-)，女，山東威海人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)微生物與免疫學。*通訊作者，教授，從事獸醫(yī)微生物與免疫學方面的研究。

2015-03-12

S 852.6

A

0517-6611(2015)11-119-01