謝美華+李霖+李雪玲+楊海艷+王振吉+范樹國

摘要：對紅豆杉葉斑病進行病原鑒定，并研究其生物學特性和殺菌劑對其抑制作用。結(jié)果表明，該病原菌為交鏈孢屬真菌；該病原菌最適宜生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為硝酸鈉。菌絲適宜生長的溫度范圍較窄，最適菌絲生長的溫度是28℃；菌絲適宜生長的pH值范圍較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長；光周期對菌落生長的影響不大。供試的殺菌劑中以百菌清的抑菌效果最好。

關鍵詞：云南紅豆杉；葉斑??；病原鑒定；生物學特性；交鏈孢屬

中圖分類號：S763.15文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0146-04

云南紅豆杉（TaxusyunnanensisChengetLu）別稱紫杉、赤柏松，屬紅豆杉科喬木，產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部，是生產(chǎn)紫杉醇的主要樹種[1-3]。云南紅豆杉是集用材、藥用、綠化于一體的珍貴樹種，特別是其紫杉醇含量遠遠高于其他紅豆杉樹種[4]。紫杉醇具有抗癌活性，云南紅豆杉的野生資源比較少，人工培育紅豆杉是目前獲取紫杉醇最可行、有效的途徑[1，5]。為了更好地保護野生云南紅豆杉野生資源，大力培育后續(xù)產(chǎn)業(yè)，以滿足市場對云南紅豆杉資源的需求，近年來在云南麗江、大理、楚雄和丘北等地建立了云南紅豆杉人工種植林。由于云南紅豆杉的廣泛栽培，病害發(fā)生嚴重，尤其是云南紅豆杉葉片葉斑病現(xiàn)象日趨普遍，影響了樹勢生長及藥用、觀賞價值。分離與鑒定病原菌是開展云南紅豆杉抗病防治研究的基礎。本試驗從自然感病的云南紅豆杉上分離純化得到1株對云南紅豆杉具有寄生作用的真菌，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察與現(xiàn)代分子生物學技術相結(jié)合的方法，對云南紅豆杉葉斑病病原菌進行了鑒定，并依據(jù)其形態(tài)特點與培養(yǎng)性狀進行了初步研究，為云南紅豆杉葉斑病的防治奠定了基礎，同時也為進一步了解該病害的發(fā)病規(guī)律提供了一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病原菌的分離

云南紅豆杉葉斑病葉片采自云南省楚雄市西山，用組織分離法分離病原菌，經(jīng)科赫氏法鑒定其為云南紅豆杉葉斑病的病原，菌株編號為hongdoushan02。

1.2病原菌的鑒定

1.2.1形態(tài)學鑒定利用顯微鏡觀察純化分離到的病原菌，并對其進行形態(tài)鑒定。

1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴增和分析用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，進行ITS-PCR擴增。引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應體系總體積25μL，反應各成分終濃度為：Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反應緩沖液。PCR擴增程序為：95℃預變性3min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃復性45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物送北京百泰克生物技術有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3生物學特性研究[6-7]

1.3.1不同碳源和氮源對菌落生長的影響

以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分別以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每種培養(yǎng)基中分別接種直徑為5mm的菌塊，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，5d后用“十”字交叉法測量菌落直徑。每個處理設3個重復。

1.3.2不同溫度對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響

取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃黑暗下恒溫培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個孢子。每個處理設3個重復。

1.3.3不同pH值對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響

將高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板，取直徑5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，黑暗條件下25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用0.2mol/L磷酸氫二鈉和0.2mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個孢子。每個處理設3個重復。

1.3.4不同光照處理

取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h黑暗環(huán)境中，25℃培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個孢子。每個處理設3個重復。

1.4不同殺菌劑對菌落生長的影響

將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋，每10mL培養(yǎng)基中加入1mL藥液制成含藥液的平板，對照組加入等量無菌水。取5mm菌塊置于察氏培養(yǎng)基平板中央，25℃黑暗培養(yǎng)5d后測量菌落直徑。每個處理設3個重復。

2結(jié)果與分析

2.1云南紅豆杉病原菌的鑒定

2.1.1形態(tài)學鑒定

該病主要發(fā)生在葉部，發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)多個黃褐色病斑，病斑邊緣黑色，隨著病情的發(fā)展，可延伸至整個葉片，使葉片枯萎死亡。在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6d菌落直徑達4cm，菌落青灰色相間，圓形、規(guī)則，邊緣整齊，菌絲絮狀，培養(yǎng)一段時間后可看到培養(yǎng)皿蓋上有水珠；背面輪紋狀，中心圓褐色，外圍一環(huán)黃色；菌落生長緩慢（圖1）。菌絲有隔，淡褐色，產(chǎn)孢細胞孔生式產(chǎn)孢，合軸式延伸或有時不再延伸；分生孢子多串生（向頂系列），有的單生，卵形或倒棍棒形，具喙，淡橄欖褐至橄欖褐色或褐色，光滑，具橫隔膜及縱向隔膜，大?。?.4～6.2）μm×（2.9～7.1）μm（平均2.65μm×6.65μm）。分生孢子頂端或喙部，常孔生式產(chǎn)生新的分生孢子，如此聯(lián)系產(chǎn)生，形成分枝或不分枝的孢子鏈（圖2、圖3）。

2.1.2病原菌rDNA-ITS序列分析

將hongdoushan02菌株的5.8SrDNA-ITS序列在NCBI里進行序列比對，結(jié)果顯示hongdoushan02與交鏈孢屬（Alternariasp.）、白菜黑斑病菌（A.brassicae）、煙草赤星病菌（A.alternata）和UnculturedAlternariaclone同源性最高，下載它們的序列，以Corynesporacassiicola為外群，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，與其遺傳距離較近的有4個種，屬內(nèi)節(jié)點支持率為1.00，結(jié)合其形態(tài)特征的觀察研究，供試菌株hongdoushan02為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）交鏈孢屬[8-16]，病原菌的種待定。

2.2不同氮源和碳源對hongdoushan02菌落生長的影響

試驗結(jié)果（表1）表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異。最適該菌生長的氮源是硝酸鈉，與牛肉膏、蛋白胨和甘氨酸差異不顯著，與其他氮源差異顯著（P<0.05）。最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉，與蔗糖和D-半乳糖差異顯著（P<0.05），與其他碳源差異不顯著。

2.3不同光照對hongdoushan02菌株生長的影響

通過24h光照、12h光/暗交替、黑暗培養(yǎng)，結(jié)果（圖5）表明，有無光照對菌落生長的影響差異不顯著。

2.4不同溫度對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖6）表明，該病原菌所能適應的溫度范圍較窄，只能在15～30℃范圍內(nèi)生長，最適的生長溫度是28℃，與25℃處理差異顯著（P<0.05），與其他處理差異極顯著（P<0.01）。該病原菌在5、10、32℃及以上溫度不能生長。

2.5不同pH值對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖7）表明，菌絲生長適應的pH值范圍較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長，不同的pH值條件下菌絲的生長差異不顯著。

2.6不同殺菌劑對菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖8）表明，與對照相比，5種廣譜殺菌劑對該菌的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。百菌清的抑菌效果和撲海因差異不顯著，與霜·錳鋅差異顯著，與敵克松和代森錳鋅差異極顯著。

3結(jié)論與討論

3.1病原菌的分離鑒定

云南紅豆杉更新能力差，對生長環(huán)境有較高要求，天然分布區(qū)域狹窄，生長緩慢，對生存空間競爭能力差。為了滿足市場對云南紅豆杉資源的需求，近年來云南省多個地區(qū)已進行大量的人工栽培。本研究通過對云南紅豆杉葉斑病病原菌進行分離純化，利用形態(tài)學特征觀察并結(jié)合分子生物學手段進行分析鑒定[11-12]，結(jié)果表明，兩者的鑒定結(jié)果相互吻合一致，初步推測病原菌為交鏈孢屬真菌。

3.2病原菌生物學特性研究

本研究結(jié)果表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，最適該菌生長的的氮源是硝酸鈉，最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉。該病原菌適宜生長的溫度范圍較窄，最適菌絲生長的溫度是28℃，在5、10、32℃及以上溫度條件下停止生長；菌絲適宜生長的pH值范圍均較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長；有無光照對菌落生長影響不顯著。

3.3廣譜殺菌劑對該菌生長的影響

在本研究中5種廣譜殺菌劑對該菌落的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。該菌的生物學特性研究都是在實驗室中進行，相對于人工大面積種植時復雜的生長環(huán)境，實驗室的環(huán)境相對單一。因此，要確定該病害的生物學特性，哪一種殺菌劑對該菌的抑制作用最好，還有待進一步的大田試驗研究。

參考文獻：

[1]李良群，楊艷光，曾英，等.云南紅豆杉內(nèi)生真菌Talaromycessp.T1BF的化學成分研究[J].廣西植物，2011，31（5）：699-701.

[2]劉萬德，蘇建榮，王夢君，等.滇西北云南紅豆杉種群空間分布格局[J].西北林學院學報，2012，27（6）：131-138.

[3]蘇建榮，臧傳富，劉萬德，等.光質(zhì)對云南紅豆杉生長及紫杉烷含量影響的研究[J].林業(yè)科學研究，2012，25（4）：419-424.

[4]王磊，張勁峰，歐曉昆，等.麗江試驗區(qū)須彌紅豆杉幼苗生長特征及紫杉醇含量變化研究[J].西部林業(yè)科學，2013，42（4）：58-62.

[5]鄭法新，程璐，李俠，等.一株產(chǎn)紫杉醇云南紅豆杉內(nèi)生真菌分離和篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（5）：440-443.

[6]李慶華.云南紅豆杉扦插繁殖技術研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2012，37（6）：126-130.

[7]趙永生，趙俊雄，張靜華.云南紅豆杉資源保護與開發(fā)利用前景[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（13）：28，31.

[8]方中達.植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[9]陸家云.植物病原真菌學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[10]HidakaY，KanedaT，AminoN，etal.Chinesemedicine，CoixseedsincreaseperipheralcytotoxicTandNKcells[J].Biotherapy，1992，5（3）：201-203.

[11]LeeMY，LinHY，ChengF，etal.Isolationandcharacterizationofnewlactamcompoundsthatinhibitlungandcoloncancercellsfromadlay（Coixlachryma-jobiL.var.ma-yuenStapf）bran[J].FoodandChemicalToxicology，2008，46（6）：1933-1939.

[12]劉艷，葉建仁.植物病害潛伏侵染研究進展[J].南京林業(yè)大學學報，2002，24（5）：69-72.

[13]劉紀鳳，范運梁.植物葉片病害的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：115，117.

[14]馬瓊，秦恩華，李又萍.魔芋白絹病病原菌的分離鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（12）：2307，2320.

[15]趙國柱，張?zhí)煊?中國磚格絲孢菌研究Ⅰ.磚格孢屬[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（1）：19-22.

[16]巴尼特HL，亨特BB.半知菌屬圖解[M].沈崇堯，譯.北京：科學出版社，1977：66-67，78-79，82-83，130-131，132-133，152-153.

2.1.2病原菌rDNA-ITS序列分析

將hongdoushan02菌株的5.8SrDNA-ITS序列在NCBI里進行序列比對，結(jié)果顯示hongdoushan02與交鏈孢屬（Alternariasp.）、白菜黑斑病菌（A.brassicae）、煙草赤星病菌（A.alternata）和UnculturedAlternariaclone同源性最高，下載它們的序列，以Corynesporacassiicola為外群，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，與其遺傳距離較近的有4個種，屬內(nèi)節(jié)點支持率為1.00，結(jié)合其形態(tài)特征的觀察研究，供試菌株hongdoushan02為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）交鏈孢屬[8-16]，病原菌的種待定。

2.2不同氮源和碳源對hongdoushan02菌落生長的影響

試驗結(jié)果（表1）表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異。最適該菌生長的氮源是硝酸鈉，與牛肉膏、蛋白胨和甘氨酸差異不顯著，與其他氮源差異顯著（P<0.05）。最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉，與蔗糖和D-半乳糖差異顯著（P<0.05），與其他碳源差異不顯著。

2.3不同光照對hongdoushan02菌株生長的影響

通過24h光照、12h光/暗交替、黑暗培養(yǎng)，結(jié)果（圖5）表明，有無光照對菌落生長的影響差異不顯著。

2.4不同溫度對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖6）表明，該病原菌所能適應的溫度范圍較窄，只能在15～30℃范圍內(nèi)生長，最適的生長溫度是28℃，與25℃處理差異顯著（P<0.05），與其他處理差異極顯著（P<0.01）。該病原菌在5、10、32℃及以上溫度不能生長。

2.5不同pH值對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖7）表明，菌絲生長適應的pH值范圍較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長，不同的pH值條件下菌絲的生長差異不顯著。

2.6不同殺菌劑對菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖8）表明，與對照相比，5種廣譜殺菌劑對該菌的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。百菌清的抑菌效果和撲海因差異不顯著，與霜·錳鋅差異顯著，與敵克松和代森錳鋅差異極顯著。

3結(jié)論與討論

3.1病原菌的分離鑒定

云南紅豆杉更新能力差，對生長環(huán)境有較高要求，天然分布區(qū)域狹窄，生長緩慢，對生存空間競爭能力差。為了滿足市場對云南紅豆杉資源的需求，近年來云南省多個地區(qū)已進行大量的人工栽培。本研究通過對云南紅豆杉葉斑病病原菌進行分離純化，利用形態(tài)學特征觀察并結(jié)合分子生物學手段進行分析鑒定[11-12]，結(jié)果表明，兩者的鑒定結(jié)果相互吻合一致，初步推測病原菌為交鏈孢屬真菌。

3.2病原菌生物學特性研究

本研究結(jié)果表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，最適該菌生長的的氮源是硝酸鈉，最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉。該病原菌適宜生長的溫度范圍較窄，最適菌絲生長的溫度是28℃，在5、10、32℃及以上溫度條件下停止生長；菌絲適宜生長的pH值范圍均較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長；有無光照對菌落生長影響不顯著。

3.3廣譜殺菌劑對該菌生長的影響

在本研究中5種廣譜殺菌劑對該菌落的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。該菌的生物學特性研究都是在實驗室中進行，相對于人工大面積種植時復雜的生長環(huán)境，實驗室的環(huán)境相對單一。因此，要確定該病害的生物學特性，哪一種殺菌劑對該菌的抑制作用最好，還有待進一步的大田試驗研究。

參考文獻：

[1]李良群，楊艷光，曾英，等.云南紅豆杉內(nèi)生真菌Talaromycessp.T1BF的化學成分研究[J].廣西植物，2011，31（5）：699-701.

[2]劉萬德，蘇建榮，王夢君，等.滇西北云南紅豆杉種群空間分布格局[J].西北林學院學報，2012，27（6）：131-138.

[3]蘇建榮，臧傳富，劉萬德，等.光質(zhì)對云南紅豆杉生長及紫杉烷含量影響的研究[J].林業(yè)科學研究，2012，25（4）：419-424.

[4]王磊，張勁峰，歐曉昆，等.麗江試驗區(qū)須彌紅豆杉幼苗生長特征及紫杉醇含量變化研究[J].西部林業(yè)科學，2013，42（4）：58-62.

[5]鄭法新，程璐，李俠，等.一株產(chǎn)紫杉醇云南紅豆杉內(nèi)生真菌分離和篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（5）：440-443.

[6]李慶華.云南紅豆杉扦插繁殖技術研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2012，37（6）：126-130.

[7]趙永生，趙俊雄，張靜華.云南紅豆杉資源保護與開發(fā)利用前景[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（13）：28，31.

[8]方中達.植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[9]陸家云.植物病原真菌學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[10]HidakaY，KanedaT，AminoN，etal.Chinesemedicine，CoixseedsincreaseperipheralcytotoxicTandNKcells[J].Biotherapy，1992，5（3）：201-203.

[11]LeeMY，LinHY，ChengF，etal.Isolationandcharacterizationofnewlactamcompoundsthatinhibitlungandcoloncancercellsfromadlay（Coixlachryma-jobiL.var.ma-yuenStapf）bran[J].FoodandChemicalToxicology，2008，46（6）：1933-1939.

[12]劉艷，葉建仁.植物病害潛伏侵染研究進展[J].南京林業(yè)大學學報，2002，24（5）：69-72.

[13]劉紀鳳，范運梁.植物葉片病害的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：115，117.

[14]馬瓊，秦恩華，李又萍.魔芋白絹病病原菌的分離鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（12）：2307，2320.

[15]趙國柱，張?zhí)煊?中國磚格絲孢菌研究Ⅰ.磚格孢屬[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（1）：19-22.

[16]巴尼特HL，亨特BB.半知菌屬圖解[M].沈崇堯，譯.北京：科學出版社，1977：66-67，78-79，82-83，130-131，132-133，152-153.

2.1.2病原菌rDNA-ITS序列分析

將hongdoushan02菌株的5.8SrDNA-ITS序列在NCBI里進行序列比對，結(jié)果顯示hongdoushan02與交鏈孢屬（Alternariasp.）、白菜黑斑病菌（A.brassicae）、煙草赤星病菌（A.alternata）和UnculturedAlternariaclone同源性最高，下載它們的序列，以Corynesporacassiicola為外群，用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采用NJ法進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，與其遺傳距離較近的有4個種，屬內(nèi)節(jié)點支持率為1.00，結(jié)合其形態(tài)特征的觀察研究，供試菌株hongdoushan02為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）交鏈孢屬[8-16]，病原菌的種待定。

2.2不同氮源和碳源對hongdoushan02菌落生長的影響

試驗結(jié)果（表1）表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異。最適該菌生長的氮源是硝酸鈉，與牛肉膏、蛋白胨和甘氨酸差異不顯著，與其他氮源差異顯著（P<0.05）。最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉，與蔗糖和D-半乳糖差異顯著（P<0.05），與其他碳源差異不顯著。

2.3不同光照對hongdoushan02菌株生長的影響

通過24h光照、12h光/暗交替、黑暗培養(yǎng)，結(jié)果（圖5）表明，有無光照對菌落生長的影響差異不顯著。

2.4不同溫度對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖6）表明，該病原菌所能適應的溫度范圍較窄，只能在15～30℃范圍內(nèi)生長，最適的生長溫度是28℃，與25℃處理差異顯著（P<0.05），與其他處理差異極顯著（P<0.01）。該病原菌在5、10、32℃及以上溫度不能生長。

2.5不同pH值對hongdoushan02菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖7）表明，菌絲生長適應的pH值范圍較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長，不同的pH值條件下菌絲的生長差異不顯著。

2.6不同殺菌劑對菌株生長的影響

試驗結(jié)果（圖8）表明，與對照相比，5種廣譜殺菌劑對該菌的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。百菌清的抑菌效果和撲海因差異不顯著，與霜·錳鋅差異顯著，與敵克松和代森錳鋅差異極顯著。

3結(jié)論與討論

3.1病原菌的分離鑒定

云南紅豆杉更新能力差，對生長環(huán)境有較高要求，天然分布區(qū)域狹窄，生長緩慢，對生存空間競爭能力差。為了滿足市場對云南紅豆杉資源的需求，近年來云南省多個地區(qū)已進行大量的人工栽培。本研究通過對云南紅豆杉葉斑病病原菌進行分離純化，利用形態(tài)學特征觀察并結(jié)合分子生物學手段進行分析鑒定[11-12]，結(jié)果表明，兩者的鑒定結(jié)果相互吻合一致，初步推測病原菌為交鏈孢屬真菌。

3.2病原菌生物學特性研究

本研究結(jié)果表明，該菌對供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，最適該菌生長的的氮源是硝酸鈉，最適該菌生長的碳源是可溶性淀粉。該病原菌適宜生長的溫度范圍較窄，最適菌絲生長的溫度是28℃，在5、10、32℃及以上溫度條件下停止生長；菌絲適宜生長的pH值范圍均較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長；有無光照對菌落生長影響不顯著。

3.3廣譜殺菌劑對該菌生長的影響

在本研究中5種廣譜殺菌劑對該菌落的生長均有抑制作用。百菌清對該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、霜·錳鋅、代森錳鋅，效果最差的是敵克松。該菌的生物學特性研究都是在實驗室中進行，相對于人工大面積種植時復雜的生長環(huán)境，實驗室的環(huán)境相對單一。因此，要確定該病害的生物學特性，哪一種殺菌劑對該菌的抑制作用最好，還有待進一步的大田試驗研究。

參考文獻：

[1]李良群，楊艷光，曾英，等.云南紅豆杉內(nèi)生真菌Talaromycessp.T1BF的化學成分研究[J].廣西植物，2011，31（5）：699-701.

[2]劉萬德，蘇建榮，王夢君，等.滇西北云南紅豆杉種群空間分布格局[J].西北林學院學報，2012，27（6）：131-138.

[3]蘇建榮，臧傳富，劉萬德，等.光質(zhì)對云南紅豆杉生長及紫杉烷含量影響的研究[J].林業(yè)科學研究，2012，25（4）：419-424.

[4]王磊，張勁峰，歐曉昆，等.麗江試驗區(qū)須彌紅豆杉幼苗生長特征及紫杉醇含量變化研究[J].西部林業(yè)科學，2013，42（4）：58-62.

[5]鄭法新，程璐，李俠，等.一株產(chǎn)紫杉醇云南紅豆杉內(nèi)生真菌分離和篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（5）：440-443.

[6]李慶華.云南紅豆杉扦插繁殖技術研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2012，37（6）：126-130.

[7]趙永生，趙俊雄，張靜華.云南紅豆杉資源保護與開發(fā)利用前景[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（13）：28，31.

[8]方中達.植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[9]陸家云.植物病原真菌學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[10]HidakaY，KanedaT，AminoN，etal.Chinesemedicine，CoixseedsincreaseperipheralcytotoxicTandNKcells[J].Biotherapy，1992，5（3）：201-203.

[11]LeeMY，LinHY，ChengF，etal.Isolationandcharacterizationofnewlactamcompoundsthatinhibitlungandcoloncancercellsfromadlay（Coixlachryma-jobiL.var.ma-yuenStapf）bran[J].FoodandChemicalToxicology，2008，46（6）：1933-1939.

[12]劉艷，葉建仁.植物病害潛伏侵染研究進展[J].南京林業(yè)大學學報，2002，24（5）：69-72.

[13]劉紀鳳，范運梁.植物葉片病害的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：115，117.

[14]馬瓊，秦恩華，李又萍.魔芋白絹病病原菌的分離鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（12）：2307，2320.

[15]趙國柱，張?zhí)煊?中國磚格絲孢菌研究Ⅰ.磚格孢屬[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（1）：19-22.

[16]巴尼特HL，亨特BB.半知菌屬圖解[M].沈崇堯，譯.北京：科學出版社，1977：66-67，78-79，82-83，130-131，132-133，152-153.