王 敏， 陳文龍， 王志仁， 盧傳禮， 朱 偉*

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510000;2. 北京回龍觀醫(yī)院，北京100096)

土茯苓是百合科植物光葉菝葜Smilax Glabra Roxb 的干燥根莖，具有解毒除濕，通利關(guān)節(jié)之功效［1］，該植物資源豐富，分布廣泛，主產(chǎn)于廣東、湖南、四川、安徽、浙江、湖北等地。近年來臨床和藥理實(shí)驗(yàn)表明，它在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗癌、抗動脈硬化和治療冠心病等［2-4］具有良好的效果。土茯苓中含有黃酮、皂苷、鞣質(zhì)、樹脂、淀粉及有機(jī)酸等化學(xué)成分，其中黃酮類成分落新婦苷、花旗松素等［5］具有重要的生理活性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用紫外分光光度法和UHPLC-LTQ-Orbitrap 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，以土茯苓總黃酮為目標(biāo)物，考察了HP-20 型大孔樹脂對土茯苓中黃酮類成分的富集純化作用。

1 材料

1.1 藥材 土茯苓(康美藥業(yè)股份有限公司，批號121205271)，經(jīng)廣東省中醫(yī)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室袁小紅研究員鑒定為百合科植物光葉菝葜Smilax Glabra Roxb 的干燥根莖。然后，將藥材進(jìn)行干燥、粉碎，過50 目篩，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 U-2910 紫外雙光束分光光度計(jì)(日本Hitachi 公司);LTQ-Orbitrap XL 組合式高分辨質(zhì)譜儀、Accela 超高壓液相色譜儀(美國Thermo Fisher 公司);B600A型離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠);BT125-D、BS224-S 電子分析天平(精度分別為十萬分之一、萬分之一，德國賽多利斯公司);Millipore 純水機(jī)(美國密理博公司)。HP-20 大孔吸附樹脂(日本三菱化學(xué)公司)。蘆丁對照品(成都曼思特生物科技有限公司，純度≥99%)。甲醇為色譜純(美國迪馬公司);其他試劑均為分析純;超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 土茯苓粗提取物的制備 取土茯苓粉末100 g，置于2 000 mL 圓底燒瓶中，70%乙醇加熱回流，提取3 次，第1 次提取2.5 h，第2 和第3 次提取2 h，4 000 r/min 離心20 min，過濾，取上清液，合并后減壓回收溶劑，濃縮蒸干，稱定質(zhì)量，4 ℃下避光保存?zhèn)溆?該乙醇粗提取物編號為TFL-Z)。

2.2 總黃酮的富集

2.2.1 樹脂的預(yù)處理 將HP-20 型樹脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后用乙醇洗至加適量水時(shí)無白色渾濁現(xiàn)象產(chǎn)生，再改用大量水洗至無醇味，備用。

2.2.2 大孔吸附樹脂分離土茯苓中的總黃酮 取TFL-Z 適量，蒸餾水100 mL 充分溶解，離心15 min (3 000 r/min)，取上清液，上HP-20 型大孔吸附樹脂柱 (40 mm × 340 mm)，用水、30%、60%、95%乙醇梯度洗脫，分別收集各梯度約5 倍于柱體積的洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮蒸干，稱定質(zhì)量，4 ℃下避光保存?zhèn)溆?分別編號為TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4)。

2.3 總黃酮測定 采用NaNO2-A1 (NO3)3-NaOH 比色法［6］，以蘆丁為對照品，試樣中加入鋁離子試劑，同時(shí)調(diào)整適當(dāng)?shù)膒H，使黃酮類物質(zhì)與鋁離子形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，然后進(jìn)行比色法測定。

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品0.005 g，70%乙醇溶解，定容至25 mL，搖勻，即得對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)，4 ℃下避光保存。然后，70%乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 的溶液。

2.3.2 方法學(xué)考察

2.3.2.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下稀釋的各質(zhì)量濃度的對照品溶液2 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，放置10 min。然后，采用紫外分光光度計(jì)法，在500 nm 波長處測定其吸光度值，每組平行3 次，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計(jì)算。結(jié)果得到回歸方程Y =2.599 1 X -0.015 2(r=0.999)，表明蘆丁在0.025 ～0.2 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液2 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色和吸光度測定，計(jì)算含有量。結(jié)果，測得總黃酮的平均含有量為89.95 μg/mL，RSD 為0.94%，表明該儀器精密度良好。

2.3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液2 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，顯色后分別放置10、20、30、40、50、60 min，測定吸光度。結(jié)果總黃酮的平均含有量為89.88 μg/mL，RSD 為0.75%，表明供試品溶液在顯色后1 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.3 不同組分中總黃酮含有量的測定 分別稱取TFLZ、TEL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 適量，70% 乙醇溶解稀釋，搖勻，使其質(zhì)量濃度為2 ×10-4g/mL，再精密吸取待測樣品溶液2 mL，按“2.3.2.1”項(xiàng)下方法測定樣品的吸光度，計(jì)算出樣品中總黃酮的含有量。結(jié)果表明，土茯苓經(jīng)70%乙醇提取后，粗提物中總黃酮的含有量為42.22%，而經(jīng)HP-20 型大孔吸附樹脂純化后，其含有量明顯提高，達(dá)66.91%，比純化前提高了1.5 倍左右，而且其總黃酮的轉(zhuǎn)移率達(dá)63.39%。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各組數(shù)據(jù)的平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s 表示，t 檢驗(yàn)進(jìn)行非配對顯著性分析，結(jié)果見表1。

表1 土茯苓粗提取物及各乙醇梯度洗脫物中的總黃酮含有量

同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，土茯苓不同組分中總黃酮的含有量存在一定差異。粗提取物經(jīng)HP-20 型大孔樹脂層析后，水(TFL-1)和95%乙醇(TFL-4)洗脫組分中的總黃酮含有量較低，而該成分主要富集于30% (TFL-2)和60%(TFL-3)乙醇洗脫組分，并且在TFL-2 中的含有量最高。另外，TFL-2 和TFL-3 中總黃酮的含有量明顯高于未經(jīng)大孔吸附樹脂富集的TFL-Z (P ＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HP-20 型大孔樹脂能有效地富集土茯苓中的總黃酮，并與乙醇體積分?jǐn)?shù)相關(guān)。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析總黃酮成分［7］采用高分辨質(zhì)譜與超高壓液相色譜(UHPLC)聯(lián)用方法，對黃酮類成分進(jìn)行快速分析與鑒定。稱取TFL-Z 適量，50%甲醇溶解，過濾，定容至5 mL，過0.22 μm 濾膜備用。

2.4.1 色譜條件 色譜柱為菲羅門kinetex (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流動相為甲醇-0.3%甲酸水溶液，梯度洗脫(0 ～30 min，15% ～95%甲醇);體積流量300 μL/min;檢測波長295 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，ESI 負(fù)離子模式;鞘氣42 單位;輔助氣8 單位;噴霧電壓3.0 kV;毛細(xì)管溫度350 ℃;管透鏡電壓-86 V;毛細(xì)管電壓-35 V;樣品先采用FT 進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z 150 ～1 500，分辨率30 000;二級和三級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描(data dependent scan，DDS);分辨率15 000;碰撞能量25% ～35%;選取上一級最高峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎片掃描;離子阱打拿極(dynode)檢測。

2.4.3 色譜圖分析 按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，取TFL-Z、TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 適量，分別進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)色譜圖，見圖1。

圖1 土茯苓粗提取物及各梯度洗脫物的重疊色譜圖(295 nm)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用UHPLC 進(jìn)行分析，結(jié)合HP-20 型大孔樹脂制備TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 時(shí)所得的指紋圖譜成分信息多于TFL-Z。由文獻(xiàn)［8］可知，土茯苓中落新婦苷的特征信號峰明顯，而TFL-Z 色譜圖(圖1)中最高的信號峰即為落新婦苷，與該文獻(xiàn)報(bào)道一致。然后，以未經(jīng)HP-20 型大孔樹脂層析的TFL-Z 圖譜作為對照，結(jié)果顯示TFL-1 圖譜中的峰低矮無序，無TFL-Z 中的特征峰;TFL-2和TFL-3 圖譜中的特征峰比TFL-Z 明顯，峰面積更大，而且兩者可追蹤TFL-Z 中所有明顯的信號峰;TFL-4 圖譜中無明顯特征峰，大多是矮峰或小的“饅頭峰”，表明HP-20型大孔樹脂對土茯苓有效成分的富集純化作用較明顯，主要集中在30% (TFL-2)和60% (TFL-3)乙醇洗脫組分(TFL-2、TFL-3)中。

2.4.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果與分析 由于土茯苓中的黃酮類成分含有較多酚羥基，屬于酸性化合物，在負(fù)離子模式下響應(yīng)值明顯，而且該模式下只有［M-H］-離子峰，故選擇負(fù)離子模式檢測土茯苓。按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，對TFL-Z進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。其中，在圖2A 所示的ESI-MS 負(fù)總離子流圖中，顯示出17 個(gè)土茯苓色譜信號峰;在圖2B所示的UHPLC-PDA 圖中，295 nm 下各色譜峰之間實(shí)現(xiàn)了較好的分離。

圖2 TFL-Z 的ESI-MS 負(fù)總離子流圖(A)和UHPLC-PDA 圖(B)

另外，通過分析各主要UHPLC 峰與總離子流圖中所對應(yīng)離子峰的質(zhì)譜信息，并結(jié)合一級質(zhì)譜掃描檢測出的準(zhǔn)分子離子峰，用于確定分子量，并根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息來推斷其元素組成。然后，通過二級質(zhì)譜掃描得到的碎片信息，對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)［8-13］，推測其對應(yīng)的化學(xué)成分歸屬，見表2。結(jié)果，初步鑒定出17個(gè)土茯苓中的化學(xué)成分，主要為二氫黃酮類化合物。

表2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析結(jié)果

在圖2A 中，化合物2 和4 的［M-H］-m/z 均為289.070 7 (C15H13O6)，并給出了相同的碎片離子m/z 245、205 和179.034，說明兩者為同分異構(gòu)體;化合物5、6、7的［M-H］-m/z 均為335.076 1 (C16H15O8)，兩者分子式相同，并具有相同的二級碎片離子;化合物10、12、13、14 的［M-H］-m/z 均為449.107 8 (C21H21O11)。另外，分子離子峰均為451.102 4，并具有相同分子式C24H19O9的化合物有3 個(gè);同為433.112 9 的化合物有2 個(gè)，而且兩者的二級質(zhì)譜也基本一致，表明為同分異構(gòu)體。通過高分辨碎片離子信息、各化合物在UHPLC 分析中所對應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間以及總離子流中的信號差異等數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的色譜保留行為和質(zhì)譜裂解進(jìn)行比較，可初步推斷化合物2 和4，5、6 和7，8 和11，10、12、13 和14，15 和17 分別為兒茶素和表兒茶素［14］，3-O-咖啡酰莽草酸、4-O-咖啡酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸［8］，辛可耐因Ia 和辛可耐因Ib［13］，落新婦苷、異落新婦苷、新落新婦苷和新異落新婦苷［11-12］，黃杞苷和異黃杞苷［9-10］。另外，化合物9 根據(jù)其波譜數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)［12］，推斷為花旗松素，屬于二氫黃酮醇類。

綜上所述，土茯苓經(jīng)HP-20 型大孔吸附樹脂富集的化學(xué)成分主要是二氫黃酮類化合物，其含有量較高，而且成分種類較多，如落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷、黃杞苷及異黃杞苷等［9-12］，這與目前的文獻(xiàn)報(bào)道相符。

3 討論

目前，對土茯苓有效成分總黃酮的分離純化工藝已有相關(guān)研究報(bào)道。吳新榮和黃少偉等［15-16］分別采用聚酰胺顆粒和D101 大孔吸附樹脂進(jìn)行工藝考察，結(jié)果顯示，材料本身性質(zhì)會影響分離純化效果。其中，HP-20 三菱化學(xué)大孔吸附樹脂作為一類新型高分子材料，以吸附量高、顆粒均勻、機(jī)械強(qiáng)度好、不易破碎、殘留物少、預(yù)處理方便等優(yōu)點(diǎn)而聞名世界。它為非極性物質(zhì)，具有相當(dāng)大的孔徑，以聚苯乙烯為基體來吸附含有π 電子的化合物(如含有苯環(huán)和共軛雙鍵的黃酮類成分)，而且普通有機(jī)溶劑、酸或堿等即可容易地洗脫被吸附物質(zhì)。因此，HP-20 大孔吸附樹脂在各領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用，特別適合分離黃酮、色素、皂苷類化合物。尚至春等［17］考察了其對南山茶花總黃酮富集純化的工藝參數(shù)，證明它對該植物的總黃酮具有良好的富集純化效果。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃酮類化合物易溶于強(qiáng)極性溶劑的性質(zhì)，選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水和95%乙醇組分中的總黃酮含有量均很低，可能是由于水的極性大，導(dǎo)致其他雜質(zhì)較多，而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高能使土茯苓總黃酮的溶解度降低，同時(shí)減弱了其與HP-20 型大孔吸附樹脂分子間的作用力。土茯苓中的大部分總黃酮經(jīng)大孔樹脂富集層析后，主要集中在30% (TFL-2)和60%(TFL-3)乙醇洗脫組分中，其中在TFL-2 中的含有量最高。此外，TFL-2 和TFL-3 中總黃酮的含有量明顯高于未經(jīng)大孔吸附樹脂富集的TFL-Z (P ＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HP-20 型大孔樹脂能有效地富集土茯苓中總黃酮。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系來測定總黃酮的含有量［6］。結(jié)果表明，該方法顯色穩(wěn)定，精密度和準(zhǔn)確度滿足含有量測定要求，而且操作簡便，是目前應(yīng)用最廣泛的總黃酮含有量測定方法。然而，該方法進(jìn)行測定時(shí)存在一些影響因素，如某些具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物(含多羥基的酚酸、咖啡酸、綠原酸等)也會和鋁離子絡(luò)合顯色。因此，在30%乙醇洗脫組分中測得蘆丁為1 340.77 mg/g 的原因可能是HP-20 型大孔吸附樹脂不僅富集了土茯苓中的黃酮類成分，同時(shí)也富集了部分酚酸和有機(jī)酸類化合物，導(dǎo)致總黃酮含有量的測定值偏高。所以，本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)來深入研究土茯苓各組分黃酮的富集效果，通過對這些成分進(jìn)行化學(xué)指認(rèn)和初步鑒定，進(jìn)一步明確了TFP-2 和TFL-3 為HP-20 型大孔樹脂富集的總黃酮餾分。

近幾年來，隨著質(zhì)譜新技術(shù)的發(fā)展，線性離子阱的多級質(zhì)譜功能和Orbitrap 高分辨質(zhì)譜結(jié)合，形成液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-LTQ-Orbitrap)，它既避免了傳統(tǒng)的先分離單體成分再做結(jié)構(gòu)鑒定的繁瑣過程，又可簡便快速地獲得各化合物的分子結(jié)構(gòu)信息，顯著提高了對中藥中復(fù)雜化學(xué)成分的快速鑒定與分析效率。本實(shí)驗(yàn)利用該技術(shù)對土茯苓中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，建立相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，然后根據(jù)精確相對分子質(zhì)量和多級質(zhì)譜碎片信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從其主要信號峰中快速辨認(rèn)了17 個(gè)化合物的歸屬。其中，兒茶素、表兒茶素、花旗松素、落新婦苷、異落新婦苷、新落新婦苷、新異落新婦苷、黃杞苷、異黃杞苷這9 個(gè)化合物均為黃酮類成分，而且落新婦苷、黃杞苷及其同分異構(gòu)體的信號峰面積較大，表明二氫黃酮類化合物在土茯苓中的含有量較高。因此，該技術(shù)從波譜數(shù)據(jù)分析鑒定方面，證明了經(jīng)HP-20 型大孔樹脂富集的化學(xué)成分即為土茯苓中的黃酮類化合物，并且與紫外分光光度法測定結(jié)果一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，顯示HP-20 型大孔吸附樹脂能有效地對土茯苓中的總黃酮進(jìn)行富集純化，為開展進(jìn)一步的相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

致謝

廣州中醫(yī)藥大學(xué)徐文老師對論文撰寫提供大力幫助，特此致謝!

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