胡曉天，向 妍，張 柯，劉齊元，范彥君，周 瑋

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省生物農(nóng)藥與制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

基于線粒體ATP6基因序列的作物系統(tǒng)發(fā)育研究

胡曉天1,2，向 妍1,2，張 柯1,2，劉齊元3，范彥君1,2，周 瑋1,2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省生物農(nóng)藥與制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

ATP6編碼ATP合酶a亞基，對(duì)酶正常功能的實(shí)現(xiàn)作用重要。為探討線粒體ATP6基因在作物系統(tǒng)發(fā)育分析上的應(yīng)用，采用NJ法的Kimura 2-parameter模型、E距離模型，以及最大似然法對(duì)30種作物進(jìn)行分子系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建，并結(jié)合植物形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，基于NJ法和最大似然法的ATP6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類(lèi)結(jié)果一致，契合現(xiàn)有植物形態(tài)學(xué)分類(lèi)，在分析作物物種分化起源上有巨大潛力。

ATP合酶；ATP6基因；作物；系統(tǒng)發(fā)育

線粒體ATP合酶也叫F1Fo-ATP合酶或復(fù)合體Ⅴ，是一個(gè)位于線粒體內(nèi)膜的旋轉(zhuǎn)酶，與呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅳ在一起[1]。線粒體ATP合酶由兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成：F1處于線粒體的基質(zhì)中，F(xiàn)o結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上[2]。F1是是水溶性的，突出于線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，由3個(gè)α和β亞基，以及1個(gè)γ、δ和ε亞基構(gòu)成[2-3]。Fo包含一個(gè)c環(huán)亞基，a、b、d、F6亞基和一個(gè)寡霉素敏感相關(guān)蛋白（the oligomycinsensitivity-conferring protein，OSCP）。隨著質(zhì)子流經(jīng)Fo部分的a亞基進(jìn)入c環(huán)亞基，質(zhì)子濃度梯度驅(qū)動(dòng)兩個(gè)分子發(fā)動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)：c環(huán)亞基繞著與之相連的中央柱狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)動(dòng)，其又帶動(dòng)被α3β3六聚體包著一端的γ亞基轉(zhuǎn)動(dòng)，為ATP合成提供能量[2]。在整個(gè)催化過(guò)程中，由于外圍柱狀結(jié)構(gòu)的作用，α3β3六聚體相對(duì)于a亞基總是保持固定。因此ATP合酶可以被機(jī)械地劃分為“轉(zhuǎn)動(dòng)子”（c環(huán)、γ、δ、ε亞基）和“固定子”（α3β3、a、b、d、F6、OSCP亞基）[2]。

ATP合酶并不是以“孤島”形式結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上的，而是有規(guī)律地以二聚體或更高形式的寡聚體組織在一起。a亞基由于可能存在大量的跨膜螺旋而被認(rèn)為對(duì)ATP合酶的二聚作用有著重要的影響[4]。兩個(gè)Fo部分的亞基：a亞基和A6L亞基分別由線粒體ATP6（mitochondrialDNA encoded ATP6，MT-ATP6）和ATP8（mitochondrial DNA encoded ATP8，MT-ATP8）編碼。在人體中，缺失了線粒體DNA（即a亞基和A6L亞基不能形成），余下的ATP合酶亞基會(huì)裝配成一個(gè)550 kD的復(fù)合體，略小于完整的ATP合酶（597kD）[4]。MT-ATP6和MT-ATP8基因的突變會(huì)引起ATP合酶的變異，MT-ATP6突變是最早報(bào)導(dǎo)[5]且目前報(bào)導(dǎo)最頻繁的ATP合酶基因缺陷；在人體中MTATP6的點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致人的一系列臨床疾病[6]。a亞基尚有另兩個(gè)功能：引導(dǎo)質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜進(jìn)入線粒體基質(zhì)中；另一功能致使在膜內(nèi)接觸a亞基的c環(huán)亞基轉(zhuǎn)動(dòng)，由此產(chǎn)生的機(jī)械能誘導(dǎo)F1外膜結(jié)構(gòu)域催化位點(diǎn)的構(gòu)象變化，幫助ATP合成[2]。

在基于序列分析的真核生物分類(lèi)上，由于26SrDNA含有能區(qū)分相同和不同物種的保守區(qū)和可變區(qū)，被廣泛地應(yīng)用于酵母分類(lèi)[7]。也有將其應(yīng)用于植物分類(lèi)并討論選取序列中的不同區(qū)段如保守核心、擴(kuò)展片段或整個(gè)序列等對(duì)構(gòu)樹(shù)結(jié)果的影響[8]。MT-ATP6所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在ATP合酶中起著重要的作用[2,4,9-10]，其序列中某些位點(diǎn)的突變可能會(huì)引發(fā)一系列生物學(xué)問(wèn)題[6,11-12]，但也可能用于物種分類(lèi)分析。文中擬以不同方法模型對(duì)多種作物ATP6序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，以探討ATP6序列在作物分類(lèi)上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）同時(shí)下載了表1中30種作物線粒體的ATP6序列。在表1作物的分類(lèi)上，使用經(jīng)典的以植物形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)的克朗奎斯特分類(lèi)法[13]。

表1 作物線粒體基因組

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將下載得到的數(shù)據(jù)分別用ClustalX軟件進(jìn)行匹配對(duì)齊，用MEGA6.06軟件中的鄰接（Neighbor-joining，NJ）距離法進(jìn)行構(gòu)樹(shù)[14]。NJ法有著許多模型參數(shù)選項(xiàng)，常用的Kimura 2-parameter模型對(duì)堿基的轉(zhuǎn)換和顛換率差異做了校正，但是假定了不同位點(diǎn)替換速率相等以及核苷酸頻率相等，這或許會(huì)導(dǎo)致一定的偏差。由π電子共振能來(lái)計(jì)算物種的系統(tǒng)發(fā)育距離在一定程度上考慮了核苷酸的替換頻率和速率；這種距離被定義為E距離，E=1-2c/（a+b），（a、b分別為被替換序列之間的π電子共振能之和，c為按位比較被替換序列之間相同堿基的π電子共振能之和，各堿基π電子共振能比值為A∶G∶C∶T= 0.32∶0.27∶0.23∶0.17），它對(duì)應(yīng)群落間按堿基能量計(jì)算的群落相異性指數(shù)[15]。通過(guò)使用NJ法中的Kimura 2-parameter模型對(duì)表1中植物的ATP相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，并進(jìn)行1 000次Bootstraps檢驗(yàn)；同時(shí)亦使用E距離模型和最大似然（Maximum Likelihood，ML）法建樹(shù)作為對(duì)比參照。

2 結(jié)果與分析

用NJ法分別構(gòu)建表1中30種作物線粒體基因ATP6的Kimura 2-parameter模型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）、E距離模型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）及最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。由圖1系統(tǒng)樹(shù)可以看出：與經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致，差別最明顯的單子葉作物和雙子葉作物被分為最大的兩類(lèi)；所有相同目的作物被歸為一個(gè)分支，其中所有相同科的作物聚在一起后再與同目不同科的作物聚在一起，所有的6種十字花科物、3種藜科作物、3種葫蘆科作物、3種豆科作物、9種禾本科作物被聚為一個(gè)單系；但是堇菜目的番木瓜未和在其他堇菜目植物（葫蘆科）聚在一起，而是和鼠李目的葡萄聚在一起。圖2中ATP6的E距離系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與Kimura 2-parameter系統(tǒng)樹(shù)類(lèi)似，都有著與經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類(lèi)一致的較好的分類(lèi)結(jié)果；在對(duì)堇菜目番木瓜和堇菜目葫蘆科植物的歸類(lèi)上，同樣支持將兩者分為不同類(lèi)。以NJ法的Kimura 2-parameter模型以及最大似然法對(duì)ATP6作圖，都顯示堇菜目番木瓜和堇菜目葫蘆科植物為不同類(lèi)目，而目前較新的APGII[16]分類(lèi)法已將番木瓜由堇菜目改為十字花目，與之前葫蘆科植物所屬堇菜目（現(xiàn)改為葫蘆目葫蘆科）區(qū)分開(kāi)。

圖1 Kimura 2-parameter 模型構(gòu)建的ATP6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 E距離模型構(gòu)建的ATP6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 最大似然法構(gòu)建的ATP6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

由此看來(lái)，具有重要生物功能的ATP6能夠?qū)⒓榷ㄗ魑镎_分類(lèi)，而且聚類(lèi)結(jié)果較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)更符合較新的植物分類(lèi)規(guī)則。線粒體ATP6編碼ATP合酶的a亞基，對(duì)ATP合酶生物學(xué)功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起著重大的作用，有著巨大的生物學(xué)分析潛力。現(xiàn)已有學(xué)者運(yùn)用MT-ATP6來(lái)對(duì)大西洋鰻魚(yú)進(jìn)行物種形成分析[17]。

一直以來(lái)，對(duì)于植物物種的分類(lèi)在不斷地發(fā)生改變，越來(lái)越多的科學(xué)家從一開(kāi)始使用克朗奎斯特形態(tài)學(xué)分類(lèi)法到現(xiàn)在逐漸傾向于較新的APGⅡ分類(lèi)法，而APG也從第一版改編到第三版?；诰€粒體ATP6基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果符合現(xiàn)有植物學(xué)分類(lèi)，或能給以后作物的分類(lèi)乃至系統(tǒng)發(fā)育和物種起源等分析提供參考。

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（責(zé)任編輯：高國(guó)賦）

Phylogenetic Analysis of Crops with Mitochondrial ATP6 Gene Sequence

HU Xiao-tian1,2，XIANG Yan1,2，ZHANG Ke1,2，LIU Qi-yuan3，F(xiàn)AN Yan-jun1,2，ZHOU Wei1,2
（1. Hunan Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, College of Plant Protection, Hunan AgriculturalUniversity,Changsha 410128,PRC; 2. Hunan Engineering & Technology Research Center for Bio-Agrochemical and Pharmaceutic Processing, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 3. Ministry of Education's Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding, College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, PRC）

ATP6 encodes the subunit a of ATP synthase and plays an important role in the normal function of enzyme. The neighborjoining Kimura 2-parameter method, neighbor-joining E method and maximum likelihood method were used to explore the phylogenetic relationships of 30 various crops base on mitochondrial gene ATP6 in this study. The results showed that the phylogenetic relationships base on mitochondrial ATP6 among species of the given crops were consistent with present morphological classifcation. The mitochondrial genes ATP6 have a great potential in speciation history of crops.

crop; ATP synthase; ATP6 gene; phylogeny

Q949

：A

：1006-060X（2015）10-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.10.001

2015-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301388）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31260350）；中國(guó)博士后特別資助項(xiàng)目（2015T80870）；中國(guó)博士后面上項(xiàng)目（2014M562109）；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ3092）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014GK3046）；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ13275）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（XCX14071）

胡曉天（1993-），男，浙江平湖市人，本科生，主要從事生物信息學(xué)研究。

周 瑋