姜紅濤 姚秀林

撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧撫順113006

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)流行性感冒病毒的比較

姜紅濤 姚秀林

撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧撫順113006

目的比較實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)流行性感冒病毒的差異。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及經(jīng)典的狗腎傳代細(xì)胞病毒分離2種方法,同時(shí)對(duì)流感監(jiān)測(cè)點(diǎn)送檢的80份疑似流感標(biāo)本檢測(cè)流感病毒。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離的陽(yáng)性數(shù)為26份,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的陽(yáng)性數(shù)為36份，χ2=8.1，P＜0.005。結(jié)論通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的確快速敏感,適用于實(shí)驗(yàn)室快速診斷。

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；細(xì)胞培養(yǎng)法；流感病毒

2013年出現(xiàn)的流感病毒H7N9經(jīng)自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來(lái)極度恐慌，引起WHO的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學(xué)的準(zhǔn)確快速診斷顯得尤為重要。該實(shí)驗(yàn)室在2014年1月采用整群抽樣法對(duì)撫順市流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的80份疑似流感樣標(biāo)本進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法與細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了檢測(cè)流行性感冒病毒的方法比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月在撫順市國(guó)家級(jí)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，每周采集內(nèi)科和兒科門(mén)診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時(shí)伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標(biāo)本，放人pH 7.4-7.6的DMEM采樣液中，當(dāng)日低溫送流感實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，每周采集20份流感樣病例的咽拭子標(biāo)本。

1.2 主要試劑

①抗A(H1N1)亞型血清，抗A(H3N2)亞型血清，抗A(H3N2)亞型血清，抗A(SWL1)亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國(guó)家流感中心提供。MDCK細(xì)胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank’液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V，采購(gòu)于BI公司。DMEM培養(yǎng)基,采購(gòu)于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3 主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒，細(xì)胞為狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)每份標(biāo)本接種細(xì)胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hank’s液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5℃培養(yǎng)，每天觀察病理變化(CPU)，當(dāng)CPU出現(xiàn)3～4個(gè)加號(hào)時(shí)，按常規(guī)法檢查維持液中的紅細(xì)胞凝集活性。將HA≥1:16的標(biāo)本采用血凝抑制方法(HI)進(jìn)行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國(guó)家流感中心做進(jìn)一步鑒定。HA≤1:16的標(biāo)本未做分型鑒定。1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系的配置[3-4]反應(yīng)條件：60℃5min→50℃30min→95℃15min→95℃15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸30s 45 cycle→72℃5min→4℃保存。見(jiàn)表1。

表1 反應(yīng)體系的配置

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P＜0.005差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對(duì)80份咽拭液檢測(cè)流行性感冒病毒的結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒26株，陽(yáng)性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽(yáng)性百分率45.00%，見(jiàn)表2。

表2 兩種方法對(duì)80份咽拭液檢測(cè)流行性感冒病毒的檢測(cè)結(jié)果[n（%）]

2.2 兩種檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒36株，陽(yáng)性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果為χ2=8.1，因?yàn)棣?0.005,1=7.88，所以P＜0.005，兩種檢驗(yàn)方法敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 兩種檢驗(yàn)方法結(jié)果比較

2.3 兩種方法對(duì)80份咽拭液檢測(cè)流行性感冒病毒的分型結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3 討論

流感病毒病原學(xué)相關(guān)檢測(cè)目前常用的有病毒分離培養(yǎng)法、快速檢測(cè)、分子生物學(xué)方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但耗時(shí)長(zhǎng)是其缺點(diǎn)。而且宿主細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)也是影響病毒生長(zhǎng)及復(fù)制的關(guān)鍵因素[6]，導(dǎo)致疑似流感樣標(biāo)本到實(shí)驗(yàn)室后，培養(yǎng)完成時(shí)間不確定。同時(shí)培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)消耗以及宿主細(xì)胞的逐漸死亡是導(dǎo)致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標(biāo)本采集后的保存運(yùn)送等環(huán)節(jié)都對(duì)MDCK培養(yǎng)分離流感病毒存在較大的影響。而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法應(yīng)用于流感病毒實(shí)驗(yàn)室診斷,國(guó)內(nèi)外早已有許多報(bào)導(dǎo)[8],它具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)所需時(shí)間短等等優(yōu)點(diǎn),尤其在應(yīng)急疫情快速診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。它與經(jīng)典的MDCK細(xì)胞分離法相比,檢測(cè)時(shí)間可縮短到1 d之內(nèi)。由于在封閉管中進(jìn)行,省略了電泳這一步驟,減少了以往PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陽(yáng)性可能[8]。

該實(shí)驗(yàn)室對(duì)2014年1月流感監(jiān)測(cè)點(diǎn)送檢的80份標(biāo)本,采用細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR兩種方法檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行比較,結(jié)果證實(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)流行性感冒病毒的檢出率為45.00%,高于細(xì)胞培養(yǎng)法的病毒檢出率32.50%。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和細(xì)胞培養(yǎng)法兩種檢驗(yàn)方法χ2檢驗(yàn)結(jié)果為χ2= 8.1，P＜0.005。對(duì)流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對(duì)流感病毒的分型也是準(zhǔn)確無(wú)誤，在病毒含量較低的標(biāo)本中不存在漏檢情況發(fā)生。通過(guò)這兩種方法的比較，與浙江省疾病預(yù)防控制中心通過(guò)比較得出的，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)大量疑似標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速鑒別診斷,實(shí)用性強(qiáng)，快速敏感[9]的結(jié)論一致。驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法確實(shí)是實(shí)驗(yàn)室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)為流感病毒陽(yáng)性的標(biāo)本接種MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)分離流感病毒，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測(cè)效率。這僅僅是本實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證結(jié)論，還需要其它研究中心加以驗(yàn)證。

[1]WHO.Human infection with influenza A（H7N9）virus in Chi-na[J].N Engl J Med,2013（368）：1888-1897.

[2]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.全國(guó)流感/人禽流感監(jiān)測(cè)實(shí)施方案(2005-2010年度)[Z].2005-09.

[3]《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)》WS285-2008[S].

[4]WHO.Sequencing primers and protocol[EB/OL]http://www.who.int/ entity/csr/resources/publications/swineflu/GenomePrimers_20090512.pdf，2011/2011,11,08.

[5]劉建軍，程小雯，賀建華.用雞胚和MDCK細(xì)胞分離流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2002（8）：335-336.

[6]馮婷，殷仲偉,李晉蓉.流感病毒H1N1在MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)及純化條件的優(yōu)化[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2012，7（7）：493-496.

[7]Youil R,Su Q,Toner TJ,et al,Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines[J].J Virol Methods,2004（120）: 23-31.

[8]Von Elden,Kenton Lohman,Luke TDaum.Simutanous Detection ofInfluenza viruses A and B using Real-Time Quantitative PCR[J].Journal of clinical Microbiology,2003,39(1):3597-3601.

[9]李嬋,盧亦愚，等.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法與RT-PCR法及細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)甲3型流行性感冒病毒的比較[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,2005，11（5）：360-363.

Comparison of Detection of Influenza Viruses between real-time Quantitative Reverse Transcriotion-polymerase Chain Reaction(RT-PCR)and Cell Culture

JIANG HongtaoYAO Xiulin
Centers for Disease Control and Prevention in Fushun，F(xiàn)ushun，Liaoning Province，113006 China

ObjectiveComparison the difference detection of influenza viruses between real-time quantitative reverse transcriotion-polymerase chain reaction(RT-PCR)and cell culture.MethodsUsing real-time quantitative RT-PCR and classic MDCK cells virus isolation two ways,censorship influenza surveillance point 80 copies of suspected flu specimens of influenza virus simultaneously.ResultsConsequence The positive of virus isolation cells is 26 copies.The positive of real-time quantitative RTPCR is 36 copies,χ2=8.1,P＜0.005.ConclusionThrough this experiment,verifying the real-time quantitative RT-PCR is really fast sensitive and suitable for rapid diagnostic laboratory.

Real-time quantitative reverse transcriotion-polymerase chain reaction(RT-PCR)；Cell culture；Flu virus

R4

A

1674-0742（2015）03（b）-0192-02

2014-12-16）

姜紅濤（1965-），女，天津人，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事病毒檢驗(yàn)工作。