孫澤敏，徐先林，歐剛衛(wèi)（遵義醫(yī)學院生物化學教研室，貴州遵義563099）

石榴皮醇提物對胃癌SCG-7901細胞增殖的影響

孫澤敏，徐先林，歐剛衛(wèi)（遵義醫(yī)學院生物化學教研室，貴州遵義563099）

目的探討石榴皮醇提物對胃癌SCG-7901細胞增殖的影響及其機制。方法體外培養(yǎng)人胃癌SCG-7901細胞。制備石榴皮醇提物，藥物最終濃度為100、80、60、40、20、10 μg/mL，并設置不加藥的陰性對照組（0 μg/mL），采用四唑鹽法、集落形成試驗觀察比較石榴皮醇提物對SCG-7901細胞增殖和克隆形成能力的影響；采用倒置顯微鏡觀察提取物作用細胞48 h后的形態(tài)變化；采用流式細胞儀檢測提取物作用48 h后細胞周期的變化。結(jié)果石榴皮醇提物對SCG-7901細胞的增殖具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性；且石榴皮醇提物顯著抑制SCG-7901細胞集落形成率。不同濃度的藥物作用后，SCG-7901細胞數(shù)目減少，部分細胞死亡，細胞核固縮；細胞周期發(fā)生改變，與陰性對照組比較，S期細胞比例減少，G0/G1期細胞增多，出現(xiàn)明顯G0/G1期阻滯。結(jié)論石榴皮醇提物可以抑制胃癌SCG-7901細胞增殖，干擾細胞G1期向S期轉(zhuǎn)化。

石榴皮/化學； 醇類/藥理學； 胃腫瘤； 細胞增殖

石榴（Punica granatum L.）屬于石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于伊朗及阿富汗等中亞地區(qū)。目前在我國陜西臨潼、山東棗莊、河南開封、安徽懷遠、四川會理、云南蒙自和新疆等地均有一定規(guī)模的石榴適生栽培區(qū)[1]。在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中主要用于久瀉、出血、蛔蟲等病癥[2]。石榴皮是石榴的干燥果皮，其成分復雜多樣，含鞣質(zhì)、黃酮類、石榴皮堿、異槲皮苷、樹脂、甘露醇、沒食子酸等，并含多種氨基酸和多種微量元素[3-4]。近年來，隨著國內(nèi)外學者對石榴藥理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)石榴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)血脂、降血壓及免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。其中抗腫瘤作用尤其受到重視，國外Ordoudi等[6]曾報道液態(tài)石榴皮萃取物可以抑制人體Burkitt淋巴瘤細胞的Raji和P3-HR1細胞群生長，并促進其凋亡；石榴籽還可以預防肝癌和抑制肝癌的轉(zhuǎn)移[7]。國內(nèi)研究也報道了石榴皮正丁醇提取物可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長[8]；石榴皮鞣花酸可明顯抑制4T1細胞增殖誘導其凋亡，誘導并提高荷瘤小鼠特異性抗腫瘤免疫反應[9]。但是目前國內(nèi)關于石榴皮提取物抗胃部腫瘤作用的藥理研究較少。本文采用醇提法提取石榴皮中有效成分，以人胃癌細胞株SCG-7901作為研究對象，應用四唑鹽（MTT）試驗、集落形成試驗、光鏡、流式細胞儀等方法研究其對人胃癌SCG-7901細胞增殖的影響，并初步探討其機制，希望為石榴皮的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 石榴皮（貴州省藥材公司，產(chǎn)地：貴州）、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）、胰蛋白酶（美國Amresco公司）、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）、吉姆薩染料（北京諾博萊德科技有限公司）、細胞周期試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標儀、冷凍干燥機（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.1.3 細胞 人胃癌細胞株SCG-7901，購自中國細胞庫典藏細胞中心，并由本教研室凍存，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮醇提物的制備 將石榴皮粉碎，過60目篩，5倍體積乙醇50℃回流提取3次，每次2 h。合并提取液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥成粉末。使用前用培養(yǎng)基溶解并稀釋至所需藥物濃度。

1.2.2 MTT試驗 取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，完全培養(yǎng)基重懸、計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為每毫升8×104個，接種至96孔板，每孔100μL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的提取物20 μL，使其終濃度分別為100、80、60、40、20、10μg/mL，同時設定陰性對照組0μg/mL（即只加細胞，不加藥）。每組5個重復。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。然后每孔加入100 μL Formanzan溶解液，平板搖床振搖5 min，使結(jié)晶紫顆粒溶解。于酶標儀的570 nm處測定吸光度。按下列公式計算生長抑制率：抑制率（%）=（A陰性對照組-A試驗組）/A陰性對照組×100%。

1.2.3 集落形成試驗 取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，完全培養(yǎng)基重懸、計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為每毫升200個，接種至6個空孔板，每孔1 mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的提取物1 mL，使其終濃度為100、80、60、40、20、10 μg/mL，同時設定不加藥的陰性對照組0 μg/mL。每組3個重復。每2天更換含藥培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)10 d。小心棄去培養(yǎng)基，甲醇固定5 min，加入新鮮配制的吉姆薩染料1 mL。室溫染色20 min，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗去多余的染料，晾干后鏡檢（100×）。計算克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 細胞形態(tài)觀察 將細胞制成單細胞懸液，接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的提取物4mL。同時設定不加藥的陰性對照組0 μg/mL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長變化情況。

1.2.5 細胞周期試驗 將細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為每毫升8 000個，接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的提取物4 mL，同時設定不加藥的陰性對照組0 μg/mL。48 h后收集細胞，用預冷的70%乙醇固定。按照細胞周期試劑盒染色，并用流式細胞儀檢測細胞周期的分布情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 石榴皮醇提物對SCG-7901細胞增殖的影響 提取物在10～100 μg/mL濃度內(nèi)可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖，并呈劑量效應關系，抑制率分別為10.21%、18.67%、32.35%、41.28%、61.85%、75.27%。以提取物濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標作回歸曲線，回歸方程為：Y=0.714X+ 3.043，R2=0.99，半數(shù)抑制率（IC50）為66 μg/mL，見圖1。

圖1 石榴皮醇提物對SGC-7901細胞增殖的影響

圖2 石榴皮醇提物對SGC-7901克隆形成率的影響

2.2 石榴皮醇提物對SCG-7901細胞克隆形成的影響 不加藥物時（即陰性對照組0 μg/mL），克隆形成能力較強，為65%。提取物在10～100 μg/mL濃度內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，克隆數(shù)減少，克隆能力減弱，抑制細胞克隆的形成。藥物濃度在100、80、60、40、20、10 μg/mL時的克隆形成率（52.34%、43.38%、39.57%、25.40%、19.02%、16.21%）與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 石榴皮醇提物對SCG-7901細胞形態(tài)的影響 陰性對照組細胞形態(tài)飽滿，貼壁明顯，折光性強，見圖3A。細胞經(jīng)1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）的提取物處理48 h以后，細胞數(shù)目銳減，細胞間連接減少，細胞質(zhì)濃縮，細胞壞死，大部分細胞懸浮于培養(yǎng)基中，見圖3B、3C。

圖3 石榴皮醇提取物對SGC-7901細胞形態(tài)的影響（100×）

2.4 石榴皮醇提物對SCG-7901細胞周期的影響 細胞經(jīng)1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）石榴皮醇提物處理48 h后與陰性對照組比較，G0/G1期細胞隨著藥物濃度的增大而增多，相應的S和G2/M期細胞減少，出現(xiàn)明顯的G0/G1阻滯。各時期DNA含量與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖3。

表1 各組不同時期DNA含量比較（±s，%）

表1 各組不同時期DNA含量比較（±s，%）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05。

組別陰性對照組（0 μg/mL）1/2IC50組（33 μg/mL）IC50組（66 μg/mL）G0/G1 S G2/M 54.61±1.35 65.80±2.33a78.40±2.51a28.60±2.81 21.64±4.29a12.46±1.73a16.82±2.24 12.55±3.12a9.11±1.78a

圖3 石榴皮醇提物對SGC-7901細胞周期的影響

3 討 論

癌癥是一種死亡率極高、嚴重威脅人類生命與健康的疾病，是全世界科學家長期以來最想攻克的難題之一[10]。WHO在2014年初發(fā)布的《世界癌癥報告》中指出，2012年有1 400萬人被診斷患癌，預測到2035年這個數(shù)據(jù)將增至2 400萬，且40歲以后的發(fā)病率和病死率呈快速上升趨勢，而胃癌的病死率居前3位[11]，因此，胃癌的研究已經(jīng)成為目前的熱點與難點。

本研究采用MTT方法檢測石榴皮醇提物對人胃癌SGC-7901細胞的增殖有明顯抑制作用，其IC50為66μg/mL，且隨著石榴皮醇提物濃度的增加抑制率逐漸上升，說明這種抑制作用具有一定的劑量依賴性；同時，集落形成試驗也證明石榴皮醇提物具有抑制腫瘤細胞克隆形成的能力，抑制腫瘤細胞的增殖，隨著石榴皮醇提物濃度的增加克隆形成數(shù)減少，具有一定的劑量依賴性。細胞經(jīng)1/2 IC50和IC50石榴皮醇提物處理48 h后，光鏡下觀察到細胞數(shù)目減少，細胞體積變圓，細胞核變小，有大量細胞碎片漂浮于培養(yǎng)液中。流式細胞儀檢測提取物對細胞周期的影響與陰性對照組比較，細胞被阻滯于G0/G1期，這有可能阻斷了細胞的生長、分裂，延長了細胞周期，從而起到抑制細胞增殖的作用[12]。

綜上所述，石榴皮醇提物對人胃癌SGC-7901細胞具有明顯的抑制作用，為接下來從醇提物中尋找具有高選擇性、低毒性的化合物奠定了一定基礎，為石榴皮的進一步開發(fā)與研究提供了一定的藥理學依據(jù)。

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Effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells

Sun Zemin，Xu Xianlin，Ou Gangwei
（Department of Biochemistry，Zunyi Medical University，Guizhou，Zunyi 563099，China）

ObjectiveTo approach the effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells and its anti-cancer mechanisms.MethodsThe gastric cancer SCG-7901 cells were cultured in vitro and the pomegranate peel granatoline was prepared whose final concentration was 100，80，60，40，20，10 μg/mL respectively.Another negative control group was set up without given medicine（0 μg/mL）.It adopted MTT and cloning assays to observe and compare the effect of pomegranate peel granatoline of on proliferation and cloning capabilities of gastric cancer SGC-7901 cells.The morphologic changes of SCG-7901 cells acted by extracts for 48 hours were observed by inverted phase contrast microscope.The periodicvariationof SCG-7901cellstreated with extractsfor 48 hourswereanalyzed by flow cytometry（FCM）.ResultsThe pomegranate peel granatoline extracts displayed obvious inhibition effect on SCG-7901 cells，being distinctive concentration-dependent and time-dependent，and it significantly inhibited the formation rate of cells colony.Acted by different-concentration extract solution，the SCG-7901 cell numbers decreased with death of partial cells and karyopy knosis as well as the cell cycle changed.Compared with the negative control group，the ratio of S-phase cells was decreased and G0/G1-phase increased，as well as an obvious block in G0/G1phase.ConclusionThe pomegranate peel granatoline extracts may inhibit the proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells，preventing the cells from G1phase to S phase.

Pericarpium Granati/chemistry； Alcohols/pharmacology； Stomach Neoplasms； Cell Proliferation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.010

：A

：1009-5519（2015）06-0826-03

2014-10-30）

貴州省科技廳基金項目（C-487）。

孫澤敏（1982-），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事胃腸道腫瘤研究；E-mail：sunzeminzunyi@163.com。

歐剛衛(wèi)（E-mail：gangwei.ou@zmc.edu.cn）。