穆 旭，李 金

(1.首鋼工學(xué)院基礎(chǔ)部，北京100041；2.北京建筑大學(xué)體育部，北京100044)

論著·基礎(chǔ)研究

肉桂酸對小鼠運動疲勞的實驗研究

穆 旭1，李 金2

(1.首鋼工學(xué)院基礎(chǔ)部，北京100041；2.北京建筑大學(xué)體育部，北京100044)

目的 探討肉桂酸對提升小鼠運動耐力的影響。方法通過建立力竭性游泳來建立小鼠力竭性運動模型，比較安靜對照組、運動訓(xùn)練組和運動給藥組小鼠力竭游泳持續(xù)時間，血漿中乳酸(LAC)含量來探討肉桂酸對小鼠的耐力提升；檢測肝臟組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化酶(CAT)的含量來探討肉桂酸的抗氧化能力，通過Western blot方法檢測肉桂酸對小鼠股四頭肌中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶表達水平來進一步研究其對小鼠運動能力提升的影響。結(jié)果肉桂酸顯著延長小鼠的游泳時間；運動給藥組與安靜對照組比較：血漿LAC含量雖然有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，肝臟組織勻漿中SOD和CAT顯著下降(P<0.05)，MDA顯著上升(P<0.01)，CAT雖下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達水平顯著下降(P<0.01)；運動訓(xùn)練組與安靜對照組比較，血漿LAC含量顯著升高(P<0.01)，肝臟組織勻漿中SOD和CAT顯著下降(P<0.01)，MDA顯著上升(P<0.01)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達水平顯著降低(P<0.01)；運動給藥組與運動訓(xùn)練組比較，血漿LAC含量顯著降低(P<0.01)，肝臟組織勻漿中SOD和CAT顯著上升(P<0.01)，MDA顯著下降(P<0.01)，CAT顯著下降(P<0.01)，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論肉桂酸具有良好的抗氧化能力和抗疲勞能力。

肉桂酸；運動耐力；抗氧化

運動員在運動和訓(xùn)練中經(jīng)常產(chǎn)生缺氧、缺血及疲勞，使機體耐力下降。如何消除劇烈運動后體內(nèi)過量的自由基，延緩和抵抗運動性疲勞的產(chǎn)生，同時提高運動成績，成為運動醫(yī)學(xué)者們研究的重要課題。有針對地使用運動保健品對提高運動訓(xùn)練效果和運動成績具有重要的意義，比如辣椒素、辣椒素脂等[1-3]。肉桂酸(cinnamic acid)即3-苯丙烯酸(3-phenyl-2-propenoic acid)，又稱桂皮酸、桂酸。是從植物中提取的一種天然芳香族有機酸，無毒性[4]，目前廣泛應(yīng)用于藥品、香料、農(nóng)藥等，具有抗菌[5]、利膽[6]、抗腫瘤[7]的作用。目前，在運動科學(xué)領(lǐng)域，You等[8]將肉桂酸衍生物——阿魏酸用于增強人和競技用馬的競技能力，發(fā)現(xiàn)加入肉桂酸衍生物可以增強舉重運動員的肌肉強度[8]；Lee等[9]通過研究指出肉桂酸本身具有抗氧化的作用，雖然肉桂酸對健康的好處受到了大量的關(guān)注，但其對力竭性運動能力的影響的研究還相對較少。因此，本研究擬通過建立小鼠力竭游泳運動損傷模型，觀察肉桂酸注射劑對力竭訓(xùn)練小鼠抗氧化能力及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶代謝的影響，為肉桂酸應(yīng)用于運動保健領(lǐng)域提供實驗依據(jù)，為其今后在競技體育運動中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 肉桂酸購自Sigma公司(美國)。

1.1.2 實驗動物 健康8周齡ICR雄性小鼠30只，體質(zhì)量(18.72±0.738)g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.3 實驗藥品 乳酸(BLAC)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超微量Na+/K+-ATP試劑盒、超微量Ca2+/Mg2+-ATP酶均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；ATP單克隆抗體購自Cell Signaling公司，β-actin單克隆抗體購自武漢博士德公司，二抗購自Invitrogen公司。

1.1.4 主要儀器 小鼠恒溫游泳池[90 cm×60 cm×45 cm，水溫(2.8±1.0)℃，水深38 cm，底部安裝有水泵形成流動水流，流速7.5 L/min]，MP200A型電子天平購自上海第二分析儀器廠，Nanodrop微量紫外分光光度計(Thermoscientific公司)、FSH-2高速電動勻漿機、DL-46RC低速冷凍離心機購自中科生物醫(yī)學(xué)高科技開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將購入的小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字法隨機分為安靜對照組、運動訓(xùn)練組、運動給藥組，每組10只。

1.2.2 動物飼養(yǎng) 動物飼養(yǎng)室溫(25±2)℃，濕度45%～55%，自然晝夜規(guī)律照明,各組每日給予基礎(chǔ)飼料，自由飲水。

1.2.3 動物給藥 根據(jù)前期預(yù)實驗中結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當肉桂酸為250 μmol/kg時效果最佳，精密稱取肉桂酸粉末0.037 g溶于3.5% NaCl溶液，經(jīng)20 U微孔濾膜高壓蒸汽滅菌15 min制成注射劑，按照體質(zhì)量從尾靜脈給藥，1 mL/10 g小鼠體質(zhì)量。正式實驗開始，運動給藥組小鼠在每天下午3：00～4：30從尾靜脈注射肉桂酸針劑，其他兩組小鼠從尾靜脈注射等體積的生理鹽水，持續(xù)14 d。

1.2.4 力竭游泳訓(xùn)練模型的建立 實驗前，對3組小鼠的體質(zhì)量和無負重力竭游泳時間進行測定。力竭判定標準[10]：小鼠頭部全部入水持續(xù)10 s不能浮出水面，撈出后平放在水平面上，不能完成翻正反射。運動給藥組小鼠在每天下午3：00～4：30從尾靜脈注射肉桂酸針劑，其他兩組小鼠從尾靜脈注射等體積的生理鹽水，1 h后進行力竭游泳訓(xùn)練。安靜對照組正?；顒樱掷m(xù)訓(xùn)練14 d，隔天進行1次無負重力竭游泳訓(xùn)練[10]。最后一次力竭游泳時，專人記錄小鼠力竭游泳時間。

1.2.5 指標檢測 最后一次力竭游泳后記錄各組小鼠力竭游泳時間。3.5%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，約2 mL，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液按照BLAC試劑盒說明書要求做ELISA檢測小鼠血漿中LAC的含量；取肝臟，生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，按照1∶9的比例加入生理鹽水，冰浴下用勻漿機勻漿，7 500 r/min低速冷凍離心機離心15 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書要求采用ELISA法對小鼠肝臟中SOD、MDA和CAT的含量進行檢測；取小鼠股四頭肌，生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，按照1∶9的比例加入生理鹽水冰浴下用勻漿機勻漿，7 500 r/min低速冷凍離心機離心15 min，吸取上清液，Nanodrop微量紫外分光光度計測定蛋白含量，各孔的蛋白上樣總量一致，均為100 μg。電泳濃縮膠80 V，50 min，分離膠110 V，150 min。經(jīng)過10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，110 V，5 mA轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫含25%脫脂奶粉的PBST(400 mL PBS+100μL Tween 20)封閉60 min，按抗體要求的比例加入兔抗小鼠一抗(1∶3 000)、β-actin兔抗小鼠一抗(l∶3 000)。4 ℃過夜，室溫復(fù)性1 h，PBST洗膜4次，每次10 min，按一定比例(l∶10 000)加入相應(yīng)的山羊抗小鼠二抗，室溫避光孵育120 min。PBS洗去未結(jié)合的二抗5次，每次5 min。用Western blot紅外熒光顯像儀顯影。

2 結(jié) 果

2.1 肉桂酸對小鼠游泳能力的影響 運動給藥組最后一次給藥后1 h，對運動訓(xùn)練組和運動給藥組進行力竭游泳測試，結(jié)果表明進行運動訓(xùn)練的兩組小鼠力竭游泳時間較安靜對照組顯著增加(P<0.01)，運動給藥組小鼠游泳時間明顯長于運動對照組(P<0.01)，見圖1。

圖1 3組小鼠力竭游泳時間

2.2 血漿中LAC的含量檢測 結(jié)果顯示，運動訓(xùn)練組小鼠血漿LAC較安靜對照組顯著升高(P<0.01)；而服用肉桂酸的運動給藥組小鼠血漿LAC相對于安靜對照組雖有所上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，相對于運動訓(xùn)練組則呈現(xiàn)顯著性降低(P<0.01)，見圖2。

2.3 肝臟中SOD、MDA和CAT含量的檢測 實驗結(jié)果表明，力竭性游泳訓(xùn)練會導(dǎo)致肝臟中SOD的活性顯著降低，運動訓(xùn)練組和安靜對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；肉桂酸給藥14 d，運動給藥組與安靜對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；運動給藥組與運動訓(xùn)練組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。力竭性游泳訓(xùn)練后，肝臟中MDA的含量顯著增加，運動訓(xùn)練組與安靜對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；運動給藥組與安靜對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；注射肉桂酸的運動給藥組與運動訓(xùn)練組比較，MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。力竭游泳訓(xùn)練后，肝臟中CAT的含量表現(xiàn)為運動訓(xùn)練組與安靜對照組比較顯著降低(P<0.01)；服用肉桂酸的運動給藥組與安靜對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；運動給藥組與運動訓(xùn)練組比較CAT的含量則顯著性上升(P<0.01)，結(jié)果見表1。

圖2 力竭性游泳后3組小鼠血漿LAC含量

表1 3組小鼠肝臟組織中SOD、MDA和CAT的含量比較

2.4 Western blot檢測小鼠股四頭肌中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶表達水平結(jié)果。

2.4.1 Western blot檢測小鼠股四頭肌 力竭性游泳后運動訓(xùn)練組和運動給藥組與安靜對照組比較均顯著降低(P<0.05)，運動給藥組的Na+/K+-ATP酶的表達水平顯著高于運動訓(xùn)練組小鼠的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.05，**：P<0.01，與安靜對照組比較；△：P<0.05，與運動訓(xùn)練組比較。1：安靜對照組；2：運動給藥組；3：運動訓(xùn)練組(n=3)。

圖3 免疫印跡法檢測小鼠肌肉中Na+/K+-ATP酶的表達

2.4.2 Western blot法檢測小鼠股四頭肌中Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達 力竭性游泳后運動訓(xùn)練組和運動給藥組與安靜對照組比較均顯著降低(P<0.01)；運動給藥組小鼠的Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達水平顯著高于運動訓(xùn)練組小鼠的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

**：P<0.01，與安靜對照組比較；△：P<0.05，與運動訓(xùn)練組比較。1：安靜對照組；2：運動給藥組；3：運動訓(xùn)練組(n=3)。

圖4 免疫印跡法檢測小鼠肌肉中Ca2+/Mg2+-ATP酶的表達

3 討 論

本次實驗得出，肉桂酸顯著提升了小鼠的運動耐力。運動員在長時間高強度運動訓(xùn)練中，肌肉為了滿足能量需求會產(chǎn)生糖酵解，必然生成大量的乳酸，乳酸在體內(nèi)堆積時可影響肌肉的收縮功能和運動能力，刺激神經(jīng)末梢，從而引起肌肉的痙攣、疼痛和局部水腫等一系列表現(xiàn)，嚴重影響訓(xùn)練效果和運動成績，因此，減少乳酸在肌肉中的堆積，可以延緩疲勞的發(fā)生或加速疲勞的消除[10]，提高運動效率。本研究結(jié)果表明，運動訓(xùn)練組小鼠血漿乳酸含量顯著增加(P<0.01)，這與運動員訓(xùn)練后的機體反應(yīng)是相符的，而給予肉桂酸的小鼠其血漿中的乳酸含量大大減少，可能是在進入機體后通過降低機體的乳酸含量，從而改善運動者的組織代謝，減輕身體內(nèi)乳酸的堆積，進而降低乳酸對肌肉和神經(jīng)末梢的影響，使運動給藥組的小鼠力竭游泳持續(xù)的時間更久，運動耐力更強。

力竭游泳還導(dǎo)致了小鼠體內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生，過量的氧自由基導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化功能失衡，由于力竭運動導(dǎo)致的體內(nèi)高度氧化損傷使運動耐力顯著下降，更易導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生，肝臟中MDA水平反映了氧自由基對細胞膜不飽和脂肪酸的破壞程度，而肝臟里存在的大量的抗氧化酶如SOD和CAT，其含量則直接反映了身體應(yīng)對由運動引起的氧化應(yīng)激的保護能力，SOD可以清除細胞內(nèi)的氧自由基和超氧陰離子自由基，抑制氧自由基帶來的細胞損傷[11]，CAT可以直接水解由于富集的ROS所產(chǎn)生的H2O2，進一步起到抗氧化的作用[12]。本實驗中，在力竭運動后，運動訓(xùn)練組的小鼠MDA顯著升高，細胞膜穩(wěn)定性下降，更易疲勞，而給予肉桂酸的運動給藥組小鼠MDA水平與運動訓(xùn)練組相比則明顯下降；其SOD和CAT水平與安靜對照組相比SOD雖然顯著下降但是遠比不給肉桂酸的運動訓(xùn)練組高，而CAT的含量已經(jīng)接近正常水平，明顯高于運動訓(xùn)練組小鼠，這些可能與肉桂酸促進了小鼠SOD和CAT的合成，促進了CAT的穩(wěn)定性，從而使體內(nèi)自由基能及時得到清除有關(guān)，MDA的降低也提示了ROS對細胞膜的毒性得到抑制，從而對小鼠具有抗疲勞的效果，力竭游泳的時間也更持久，運動耐力得到增強。

ATP酶是生物膜上的一種重要的活性蛋白酶，其在物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞方面具有重要的作用[13]。當劇烈運動引起氧化應(yīng)激時，膜的完整性和流動性都受到了破壞，受損的生物膜使ATP酶的活性降低，從而使神經(jīng)信號的傳導(dǎo)以及骨骼肌的收縮受到影響，更易引起痙攣和運動疲勞的產(chǎn)生[14]。本實驗證實了劇烈運動引起的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致生物膜的損傷，從而使ATP酶的含量降低，給予肉桂酸的運動給藥組小鼠生物膜完整性和流動性得到保護，神經(jīng)信號傳導(dǎo)更好，對肌肉的調(diào)控更靈敏，同時線粒體供能更強，骨骼肌的抗疲勞能力更顯著，運動耐力得到提升。

肉桂酸在運動保健方面的功能有望為運動員和運動愛好者提高運動表現(xiàn)發(fā)揮作用，本實驗結(jié)果對防止運動損傷、提高運動能力的臨床治療及運動保健補劑的開發(fā)均提供了重要的實驗依據(jù)。

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Experiment research of cinnamic acid on endurance exercise in mice

MuXu1,LiJin2

(1.DepartmentFoundation,ShougangInstituteofTechnology，Beijing100041，China；2.SportsSection,BeijingUniversityofCivilEngineeringandArchitecture，Beijing100044，China)

Objective To investigate the effects of cinnamic acid to enhance the exercise endurance in mice.MethodsThrough the exhaustive swimming to establish mice exhaustive exercise model,the mice were divided into control group,exercise control group and exercise cinnamic group(n=10),the mice exhaustive swimming time were comparted,blood lactic acid(LAC) levels were used to explore the endurance of cinnamic acid in mice;the super oxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA) and peroxidase (CAT) content in liver homogenates were used to detect mice endurance enhancement and antioxidant capacity of cinnamic acid,and expression of Na+/K+-ATP enzyme,Ca2+/Mg2+-ATP enzyme on mice quadriceps by Western blot to further study its effect on improving exercise capacity in mice.ResultsCinnamic acid significantly prolonged the swimming time of mice;Exercise cinnamic group compared with control group:although the LAC content in plasma elevated,the difference was not statistically significant(P>0.05),SOD and CAT in liver homogenate was significantly decreased(P<0.05),MDA increased significantly(P<0.01),CAT was decreased but with no statistically significant(P>0.05),the expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/Mg2+-ATP enzyme decreased significantly(P<0.01).Exercise control group compared with control group:the LAC content in plasma increased significantly(P<0.01),SOD and CAT in liver homogenate was significantly decreased(P<0.01),MDA increased significantly(P<0.01),expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/enzyme Mg2+-ATP decreased significantly(P<0.01);Exercise cinnamic group exercise control group:the LAC content in plasma was significantly reduced(P<0.01),SOD and CAT in liver tissue significantly increased(P<0.01),MDA decreased significantly(P<0.01),CAT decreased significantly(P<0.01),the expression level of Na+/K+-ATP enzyme and Ca2+/Mg2+-ATP enzyme decreased significantly(P<0.05).ConclusionCinnamic acid has good oxidation resistances and anti-fatigue ability.

cinnamic acid;endurance exercise;antioxidant

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.011

穆旭(1979-)，副教授，碩士,主要從事運動營養(yǎng)康復(fù)和體育教育理論研究。

R872.7

A

1671-8348(2015)35-4932-04

2015-05-15

2015-07-21)