于錫宏+戴忠仁+蔣欣梅+董然

摘 要：以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響。結(jié)果表明，與冷脅迫和常溫條件下的正常植株相比，冷脅迫后的基因沉默植株的相對電導率和丙二醛含量均顯著增加，葉綠素含量顯著降低；冷脅迫后的基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度遠遠低于冷脅迫后的正常植株增加的幅度。

關(guān)鍵詞：冷脅迫；黃瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指標

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2014）22-0042-03

黃瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有組織以及果實器官都對低溫敏感，通常溫度在10～12℃以下時其生理活動失調(diào)、生長減緩或停止發(fā)育，5℃以下則難以適應[1]。黑龍江省位于高緯度地區(qū)，春秋季節(jié)易遭受寒流的侵襲，冷害多發(fā)，而作為我省冬春設(shè)施反季節(jié)生產(chǎn)的主栽蔬菜之一，冷敏感性已經(jīng)成為黃瓜正常生長的主要限制因子。因此，研究黃瓜的冷脅迫機理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。

本試驗以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響，通過對相對電導率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及葉綠素含量的分析，試圖研究黃瓜冷脅迫反應的生理機制，為改進低溫條件下黃瓜的栽培措施和研究黃瓜冷脅迫的生理機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黃瓜沉默植株的獲得

根據(jù)CBF1基因編碼區(qū)的cDNA序列，設(shè)計帶有相應酶切位點的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黃瓜cDNA為模板，PCR擴增目的片段，回收后克隆到pMD18-T載體，進行雙酶切定向克隆在pgR107 載體的Cla I和Sal I多克隆位點，構(gòu)建pgR107-CBF1。以本實驗室保存黃瓜品種Y081無菌組培苗為試驗材料，將無菌苗移栽到營養(yǎng)缽中，轉(zhuǎn)到晝夜平均溫度18℃條件下的人工氣候箱中生長，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入葉片葉脈中，獲得基因沉默植株。

1.2 試驗處理

將基因沉默后的植株（T）放置在平均溫度為18℃的條件下預處理1 d，然后置于晝夜平均溫度7.5℃的光照培養(yǎng)箱中冷脅迫處理3 d，為了消除光照培養(yǎng)箱內(nèi)因弱光條件而引起的試驗誤差，我們把始終處于常溫條件下未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照1（CK1），以采用相同方式進行冷處理的未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照2（CK2）。隨機選取功能葉進行相關(guān)生理生化指標的測定，其中相對電導率測定采用外滲電導法[2]；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量測定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[3]；葉綠素含量測定采用丙酮比色法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相對電導率和葉綠素含量的影響

如表1所示，與常溫條件下生長的對照CK1相比，經(jīng)過冷脅迫后可以使植株葉片中的丙二醛含量和相對電導率顯著提高，而葉綠素含量顯著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相對電導率表現(xiàn)最高，顯著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的葉綠素含量最低，顯著低于CK1和CK2。處理T中的丙二醛含量和相對電導率比CK2分別高10.96%和41.48%，葉綠素含量比CK2降低了42.37%。說明冷脅迫對基因沉默植株的傷害要重于對照植株，可能已給植株造成不可恢復的傷害，其細胞膜系統(tǒng)的正常代謝活動已遭到破壞。

2.2 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

通過比較冷脅迫下基因沉默植株與對照植株之間脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化可以看出（表2），冷脅迫后黃瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加，但與常溫對照CK1比，冷脅迫后基因沉默植株（T）體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。

3 結(jié)論與討論

冷脅迫對植物的整個生理代謝過程均產(chǎn)生影響，包括細胞原生質(zhì)體的流動減緩和停滯、細胞器結(jié)構(gòu)的破壞、有機物的合成受阻和運輸緩慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷脅迫對植物造成傷害的一個重要方面是質(zhì)膜相變引起的電解質(zhì)外滲，而相對電導率是一個對低溫比較敏感的指標，而且簡便易測，能反映特定低溫下質(zhì)膜的透性[5]，為大多數(shù)研究者所使用。同時膜脂過氧化的終極分解產(chǎn)物是丙二醛，其含量的多少可反映膜質(zhì)過氧化的程度，也間接反映了生物體抗氧化能力的強弱，其含量越高，說明植株遭受逆境傷害的程度越嚴重。張學明[6]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的丙二醛含量可表征細胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，細胞膜的透性越大；劉建輝等[7]認為，冷脅迫后的冷敏型黃瓜相對電導率高于耐冷型黃瓜。在果樹上也有類似的報道，宋洪偉等[8]的研究表明，耐冷性強的懸鉤子屬、獼猴桃屬和醋栗屬的小漿果冷脅迫后膜脂不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值及不飽和度均較高，細胞膜的穩(wěn)定性相對較高；劉艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，耐冷性強的梨品種體內(nèi)脂肪及脂類物質(zhì)的積累顯著的高于不耐冷品種。植物的生長發(fā)育與植物體的光合作用緊密相關(guān)，低溫對光合作用的影響也最大，葉綠體是植物體進行光合作用的主要場所，對冷脅迫最為敏感[10]，王毅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量顯著降低，細胞正常代謝受影響；樊懷福等[12]發(fā)現(xiàn)冷脅迫后番茄的葉綠素和類胡蘿卜素含量降低。這與我們的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明顯低于對照植株，沉默植株正常生理代謝受到抑制，體內(nèi)相對電導率和丙二醛含量顯著增加，葉綠素含量顯著降低。

冷脅迫下植物體內(nèi)游離蛋白質(zhì)含量和脯氨酸含量增加，可有利于細胞保水性的增加，降低細胞的結(jié)冰溫度，提高植物的耐冷性。有些學者研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜冷脅迫期間，體內(nèi)可溶性蛋白含量和耐冷性之間呈正相關(guān)的關(guān)系，林善枝等[13]的研究表明，冷脅迫過程中毛白楊幼苗蛋白質(zhì)含量的增加與其耐冷性和存活率的增強密切相關(guān)。對于蛋白質(zhì)與植物耐冷性的關(guān)系，也有學者提出了不同的觀點，簡令成[14]認為，植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的增加與植物耐冷性的增強無明顯的因果關(guān)系，可溶性蛋白質(zhì)含量在冷脅迫條件下無明顯變化；何若韞[15]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下稻米體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，而游離氨基酸含量增加，與耐冷型品種相比，冷敏型品種的可溶性蛋白質(zhì)更低。我們的試驗結(jié)果表明，冷脅迫后黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量增加的幅度遠遠低于未沉默植株增加幅度。

參考文獻

[1] 山東農(nóng)業(yè)大學.蔬菜栽培學總論[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[2] 高俊鳳.植物生理學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2006.

[3] 郝再斌，蒼晶，徐仲.植物生理實驗[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學出版社，2006.

[4] 李美茹，劉鴻先.植物細胞中的抗寒物質(zhì)及其與植物耐冷性的關(guān)系[J].植物生理學通訊，1995（5）：328-334.

[5] 逯明輝，婁群峰，陳勁楓.黃瓜的冷害及耐冷性[J].植物學通報，2004，21（5）：578-586.

[6] 張學明.桉樹在低溫脅迫下的脂膜過氧化作用和膜傷害[J].經(jīng)濟林研究，1994（S1）：12-14.

[7] 劉建輝，崔鴻文.電導法鑒定黃瓜抗寒性的研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報，1995（4）：74-77.

[8] 宋洪偉，董英山.用膜脂脂肪酸法鑒定小漿果資源的抗寒性[J].落葉果樹，2000（3）：6-8.

[9] 劉艷，趙虎成，李雄，等.梨枝條中淀粉、還原糖及脂類物質(zhì)動態(tài)變化與抗寒性的關(guān)系[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2002，23（1）：57-60.

[10] 任旭琴，陳伯清.低溫下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（6）：243-244.

[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黃瓜幼苗低溫鍛煉對葉片細胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響[J].園藝學報，1995（3）：299-300.

[12] 樊懷福，蔣衛(wèi)杰，郭世榮.低溫對番茄幼苗植株生長和葉片光合作用的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2005（3）：89-91.

[13] 林善枝，李雪平，張志毅.在低溫誘導毛白楊抗凍性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的變化[J].北京林業(yè)大學學報，2001，23（5）：4-9.

[14] 簡令成.植物抗寒機理研究的新進展[J].植物學通報，1992（3）：17-22.

[15] 何若韞.植物低溫逆境生理[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.endprint

摘 要：以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響。結(jié)果表明，與冷脅迫和常溫條件下的正常植株相比，冷脅迫后的基因沉默植株的相對電導率和丙二醛含量均顯著增加，葉綠素含量顯著降低；冷脅迫后的基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度遠遠低于冷脅迫后的正常植株增加的幅度。

關(guān)鍵詞：冷脅迫；黃瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指標

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2014）22-0042-03

黃瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有組織以及果實器官都對低溫敏感，通常溫度在10～12℃以下時其生理活動失調(diào)、生長減緩或停止發(fā)育，5℃以下則難以適應[1]。黑龍江省位于高緯度地區(qū)，春秋季節(jié)易遭受寒流的侵襲，冷害多發(fā)，而作為我省冬春設(shè)施反季節(jié)生產(chǎn)的主栽蔬菜之一，冷敏感性已經(jīng)成為黃瓜正常生長的主要限制因子。因此，研究黃瓜的冷脅迫機理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。

本試驗以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響，通過對相對電導率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及葉綠素含量的分析，試圖研究黃瓜冷脅迫反應的生理機制，為改進低溫條件下黃瓜的栽培措施和研究黃瓜冷脅迫的生理機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黃瓜沉默植株的獲得

根據(jù)CBF1基因編碼區(qū)的cDNA序列，設(shè)計帶有相應酶切位點的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黃瓜cDNA為模板，PCR擴增目的片段，回收后克隆到pMD18-T載體，進行雙酶切定向克隆在pgR107 載體的Cla I和Sal I多克隆位點，構(gòu)建pgR107-CBF1。以本實驗室保存黃瓜品種Y081無菌組培苗為試驗材料，將無菌苗移栽到營養(yǎng)缽中，轉(zhuǎn)到晝夜平均溫度18℃條件下的人工氣候箱中生長，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入葉片葉脈中，獲得基因沉默植株。

1.2 試驗處理

將基因沉默后的植株（T）放置在平均溫度為18℃的條件下預處理1 d，然后置于晝夜平均溫度7.5℃的光照培養(yǎng)箱中冷脅迫處理3 d，為了消除光照培養(yǎng)箱內(nèi)因弱光條件而引起的試驗誤差，我們把始終處于常溫條件下未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照1（CK1），以采用相同方式進行冷處理的未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照2（CK2）。隨機選取功能葉進行相關(guān)生理生化指標的測定，其中相對電導率測定采用外滲電導法[2]；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量測定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[3]；葉綠素含量測定采用丙酮比色法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相對電導率和葉綠素含量的影響

如表1所示，與常溫條件下生長的對照CK1相比，經(jīng)過冷脅迫后可以使植株葉片中的丙二醛含量和相對電導率顯著提高，而葉綠素含量顯著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相對電導率表現(xiàn)最高，顯著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的葉綠素含量最低，顯著低于CK1和CK2。處理T中的丙二醛含量和相對電導率比CK2分別高10.96%和41.48%，葉綠素含量比CK2降低了42.37%。說明冷脅迫對基因沉默植株的傷害要重于對照植株，可能已給植株造成不可恢復的傷害，其細胞膜系統(tǒng)的正常代謝活動已遭到破壞。

2.2 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

通過比較冷脅迫下基因沉默植株與對照植株之間脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化可以看出（表2），冷脅迫后黃瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加，但與常溫對照CK1比，冷脅迫后基因沉默植株（T）體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。

3 結(jié)論與討論

冷脅迫對植物的整個生理代謝過程均產(chǎn)生影響，包括細胞原生質(zhì)體的流動減緩和停滯、細胞器結(jié)構(gòu)的破壞、有機物的合成受阻和運輸緩慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷脅迫對植物造成傷害的一個重要方面是質(zhì)膜相變引起的電解質(zhì)外滲，而相對電導率是一個對低溫比較敏感的指標，而且簡便易測，能反映特定低溫下質(zhì)膜的透性[5]，為大多數(shù)研究者所使用。同時膜脂過氧化的終極分解產(chǎn)物是丙二醛，其含量的多少可反映膜質(zhì)過氧化的程度，也間接反映了生物體抗氧化能力的強弱，其含量越高，說明植株遭受逆境傷害的程度越嚴重。張學明[6]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的丙二醛含量可表征細胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，細胞膜的透性越大；劉建輝等[7]認為，冷脅迫后的冷敏型黃瓜相對電導率高于耐冷型黃瓜。在果樹上也有類似的報道，宋洪偉等[8]的研究表明，耐冷性強的懸鉤子屬、獼猴桃屬和醋栗屬的小漿果冷脅迫后膜脂不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值及不飽和度均較高，細胞膜的穩(wěn)定性相對較高；劉艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，耐冷性強的梨品種體內(nèi)脂肪及脂類物質(zhì)的積累顯著的高于不耐冷品種。植物的生長發(fā)育與植物體的光合作用緊密相關(guān)，低溫對光合作用的影響也最大，葉綠體是植物體進行光合作用的主要場所，對冷脅迫最為敏感[10]，王毅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量顯著降低，細胞正常代謝受影響；樊懷福等[12]發(fā)現(xiàn)冷脅迫后番茄的葉綠素和類胡蘿卜素含量降低。這與我們的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明顯低于對照植株，沉默植株正常生理代謝受到抑制，體內(nèi)相對電導率和丙二醛含量顯著增加，葉綠素含量顯著降低。

冷脅迫下植物體內(nèi)游離蛋白質(zhì)含量和脯氨酸含量增加，可有利于細胞保水性的增加，降低細胞的結(jié)冰溫度，提高植物的耐冷性。有些學者研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜冷脅迫期間，體內(nèi)可溶性蛋白含量和耐冷性之間呈正相關(guān)的關(guān)系，林善枝等[13]的研究表明，冷脅迫過程中毛白楊幼苗蛋白質(zhì)含量的增加與其耐冷性和存活率的增強密切相關(guān)。對于蛋白質(zhì)與植物耐冷性的關(guān)系，也有學者提出了不同的觀點，簡令成[14]認為，植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的增加與植物耐冷性的增強無明顯的因果關(guān)系，可溶性蛋白質(zhì)含量在冷脅迫條件下無明顯變化；何若韞[15]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下稻米體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，而游離氨基酸含量增加，與耐冷型品種相比，冷敏型品種的可溶性蛋白質(zhì)更低。我們的試驗結(jié)果表明，冷脅迫后黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量增加的幅度遠遠低于未沉默植株增加幅度。

參考文獻

[1] 山東農(nóng)業(yè)大學.蔬菜栽培學總論[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

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[3] 郝再斌，蒼晶，徐仲.植物生理實驗[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學出版社，2006.

[4] 李美茹，劉鴻先.植物細胞中的抗寒物質(zhì)及其與植物耐冷性的關(guān)系[J].植物生理學通訊，1995（5）：328-334.

[5] 逯明輝，婁群峰，陳勁楓.黃瓜的冷害及耐冷性[J].植物學通報，2004，21（5）：578-586.

[6] 張學明.桉樹在低溫脅迫下的脂膜過氧化作用和膜傷害[J].經(jīng)濟林研究，1994（S1）：12-14.

[7] 劉建輝，崔鴻文.電導法鑒定黃瓜抗寒性的研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報，1995（4）：74-77.

[8] 宋洪偉，董英山.用膜脂脂肪酸法鑒定小漿果資源的抗寒性[J].落葉果樹，2000（3）：6-8.

[9] 劉艷，趙虎成，李雄，等.梨枝條中淀粉、還原糖及脂類物質(zhì)動態(tài)變化與抗寒性的關(guān)系[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2002，23（1）：57-60.

[10] 任旭琴，陳伯清.低溫下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（6）：243-244.

[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黃瓜幼苗低溫鍛煉對葉片細胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響[J].園藝學報，1995（3）：299-300.

[12] 樊懷福，蔣衛(wèi)杰，郭世榮.低溫對番茄幼苗植株生長和葉片光合作用的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2005（3）：89-91.

[13] 林善枝，李雪平，張志毅.在低溫誘導毛白楊抗凍性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的變化[J].北京林業(yè)大學學報，2001，23（5）：4-9.

[14] 簡令成.植物抗寒機理研究的新進展[J].植物學通報，1992（3）：17-22.

[15] 何若韞.植物低溫逆境生理[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.endprint

摘 要：以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響。結(jié)果表明，與冷脅迫和常溫條件下的正常植株相比，冷脅迫后的基因沉默植株的相對電導率和丙二醛含量均顯著增加，葉綠素含量顯著降低；冷脅迫后的基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度遠遠低于冷脅迫后的正常植株增加的幅度。

關(guān)鍵詞：冷脅迫；黃瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指標

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2014）22-0042-03

黃瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有組織以及果實器官都對低溫敏感，通常溫度在10～12℃以下時其生理活動失調(diào)、生長減緩或停止發(fā)育，5℃以下則難以適應[1]。黑龍江省位于高緯度地區(qū)，春秋季節(jié)易遭受寒流的侵襲，冷害多發(fā)，而作為我省冬春設(shè)施反季節(jié)生產(chǎn)的主栽蔬菜之一，冷敏感性已經(jīng)成為黃瓜正常生長的主要限制因子。因此，研究黃瓜的冷脅迫機理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。

本試驗以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關(guān)耐冷指標的影響，通過對相對電導率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及葉綠素含量的分析，試圖研究黃瓜冷脅迫反應的生理機制，為改進低溫條件下黃瓜的栽培措施和研究黃瓜冷脅迫的生理機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黃瓜沉默植株的獲得

根據(jù)CBF1基因編碼區(qū)的cDNA序列，設(shè)計帶有相應酶切位點的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黃瓜cDNA為模板，PCR擴增目的片段，回收后克隆到pMD18-T載體，進行雙酶切定向克隆在pgR107 載體的Cla I和Sal I多克隆位點，構(gòu)建pgR107-CBF1。以本實驗室保存黃瓜品種Y081無菌組培苗為試驗材料，將無菌苗移栽到營養(yǎng)缽中，轉(zhuǎn)到晝夜平均溫度18℃條件下的人工氣候箱中生長，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入葉片葉脈中，獲得基因沉默植株。

1.2 試驗處理

將基因沉默后的植株（T）放置在平均溫度為18℃的條件下預處理1 d，然后置于晝夜平均溫度7.5℃的光照培養(yǎng)箱中冷脅迫處理3 d，為了消除光照培養(yǎng)箱內(nèi)因弱光條件而引起的試驗誤差，我們把始終處于常溫條件下未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照1（CK1），以采用相同方式進行冷處理的未經(jīng)侵染處理的正常植株作為對照2（CK2）。隨機選取功能葉進行相關(guān)生理生化指標的測定，其中相對電導率測定采用外滲電導法[2]；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量測定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[3]；葉綠素含量測定采用丙酮比色法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相對電導率和葉綠素含量的影響

如表1所示，與常溫條件下生長的對照CK1相比，經(jīng)過冷脅迫后可以使植株葉片中的丙二醛含量和相對電導率顯著提高，而葉綠素含量顯著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相對電導率表現(xiàn)最高，顯著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的葉綠素含量最低，顯著低于CK1和CK2。處理T中的丙二醛含量和相對電導率比CK2分別高10.96%和41.48%，葉綠素含量比CK2降低了42.37%。說明冷脅迫對基因沉默植株的傷害要重于對照植株，可能已給植株造成不可恢復的傷害，其細胞膜系統(tǒng)的正常代謝活動已遭到破壞。

2.2 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

通過比較冷脅迫下基因沉默植株與對照植株之間脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化可以看出（表2），冷脅迫后黃瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加，但與常溫對照CK1比，冷脅迫后基因沉默植株（T）體內(nèi)脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。

3 結(jié)論與討論

冷脅迫對植物的整個生理代謝過程均產(chǎn)生影響，包括細胞原生質(zhì)體的流動減緩和停滯、細胞器結(jié)構(gòu)的破壞、有機物的合成受阻和運輸緩慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷脅迫對植物造成傷害的一個重要方面是質(zhì)膜相變引起的電解質(zhì)外滲，而相對電導率是一個對低溫比較敏感的指標，而且簡便易測，能反映特定低溫下質(zhì)膜的透性[5]，為大多數(shù)研究者所使用。同時膜脂過氧化的終極分解產(chǎn)物是丙二醛，其含量的多少可反映膜質(zhì)過氧化的程度，也間接反映了生物體抗氧化能力的強弱，其含量越高，說明植株遭受逆境傷害的程度越嚴重。張學明[6]研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的丙二醛含量可表征細胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，細胞膜的透性越大；劉建輝等[7]認為，冷脅迫后的冷敏型黃瓜相對電導率高于耐冷型黃瓜。在果樹上也有類似的報道，宋洪偉等[8]的研究表明，耐冷性強的懸鉤子屬、獼猴桃屬和醋栗屬的小漿果冷脅迫后膜脂不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值及不飽和度均較高，細胞膜的穩(wěn)定性相對較高；劉艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，耐冷性強的梨品種體內(nèi)脂肪及脂類物質(zhì)的積累顯著的高于不耐冷品種。植物的生長發(fā)育與植物體的光合作用緊密相關(guān)，低溫對光合作用的影響也最大，葉綠體是植物體進行光合作用的主要場所，對冷脅迫最為敏感[10]，王毅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量顯著降低，細胞正常代謝受影響；樊懷福等[12]發(fā)現(xiàn)冷脅迫后番茄的葉綠素和類胡蘿卜素含量降低。這與我們的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明顯低于對照植株，沉默植株正常生理代謝受到抑制，體內(nèi)相對電導率和丙二醛含量顯著增加，葉綠素含量顯著降低。

冷脅迫下植物體內(nèi)游離蛋白質(zhì)含量和脯氨酸含量增加，可有利于細胞保水性的增加，降低細胞的結(jié)冰溫度，提高植物的耐冷性。有些學者研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜冷脅迫期間，體內(nèi)可溶性蛋白含量和耐冷性之間呈正相關(guān)的關(guān)系，林善枝等[13]的研究表明，冷脅迫過程中毛白楊幼苗蛋白質(zhì)含量的增加與其耐冷性和存活率的增強密切相關(guān)。對于蛋白質(zhì)與植物耐冷性的關(guān)系，也有學者提出了不同的觀點，簡令成[14]認為，植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的增加與植物耐冷性的增強無明顯的因果關(guān)系，可溶性蛋白質(zhì)含量在冷脅迫條件下無明顯變化；何若韞[15]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下稻米體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，而游離氨基酸含量增加，與耐冷型品種相比，冷敏型品種的可溶性蛋白質(zhì)更低。我們的試驗結(jié)果表明，冷脅迫后黃瓜CBF1基因沉默植株體內(nèi)的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量增加的幅度遠遠低于未沉默植株增加幅度。

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