楊偉珍 鄺桂星 蘇 丹 陳盛強(qiáng)

牙周病是一種多因素炎癥性破壞性疾病，一些危險(xiǎn)因素，如基因、環(huán)境或宿主免疫系統(tǒng)等會(huì)加重病情，有家族聚集性。由于牙周炎早期多無(wú)明顯自覺(jué)癥狀，如果早期的牙齦炎沒(méi)有及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，炎癥可由牙齦向深層擴(kuò)散至牙周膜、牙槽骨而發(fā)展成牙周炎。嚴(yán)重的牙周炎不能保留牙齒，本研究將比較Foxp3 -3279 各位點(diǎn)基因型和等位基因在牙周炎病人和正常對(duì)照組的分布，尋找在牙周炎病人中差異表達(dá)的基因，為牙周炎的的發(fā)病機(jī)制提供一定的免疫學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2011 ～2014 年廣州市番禺區(qū)石碁人民醫(yī)院和番禺南村醫(yī)院口腔門診重度成人牙周炎患者共50 例，其中男23 例，女27 例;年齡38 ～61 歲，病程5 年～30 余年，所有患者都進(jìn)行牙骨X 線拍攝結(jié)合臨床檢查確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中華口腔學(xué)》，經(jīng)檢查排除牙周炎疾病的103 例健康對(duì)照者，年齡與患者組相當(dāng)，對(duì)照組的年齡及性別和牙周炎患者組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有檢測(cè)者近期均未服用影響檢測(cè)的藥物。

1.1.2 材料 從基因庫(kù)檢索Foxp3 基因序列，根據(jù)序列使用Primer Premer5.0 設(shè)計(jì)Foxp3 -3279 位點(diǎn)引物，并使用NCBI 的Blast 軟件對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。Foxp3 -3279 位點(diǎn)PCR 引物序列如下:正向引物［A］5＇ - CTGGCTCTCTCCCCAACTGA -3＇，［C］5＇ - CTGGCTCTCTCCCCAACTGC -3＇ 反向引物R5＇ -ACAGAGCCCATCATCAGACTCTCTA - 3＇。引物，標(biāo)本基因組DNA 抽提試劑和PCR 試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 標(biāo)本基因組DNA 制備，采集研究對(duì)象EDTA 抗凝血5 ml，常規(guī)使用苯酚-氯仿抽提法從外周血白細(xì)胞中提取DNA。

2.2 Foxp3 - 3279 位點(diǎn)基因的檢測(cè) PCR - SSP(polymerase chain reaction with sequence -specific primers)法，在滅菌的0.2 mL 離心管中，按順序分別加入:模板DNA 3.0 μl，10 ×PCR Buffer 3.0 μl，Taq DNA 酶1.0 μl，DNTP 3.0 μl，Primer 1 和2 各1.0 μl，加水至總積為30 μl。94℃預(yù)變性240 s，94℃變性55 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行30 次PCR 循環(huán);72℃充分延伸7 min。

2.3 目的基因的鑒定 在1.5%瓊脂糖凝膠中對(duì)擴(kuò)增基因片段進(jìn)行電泳。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算牙周炎組和對(duì)照組Foxp3 -3279 位點(diǎn)各基因型頻率和等位基因頻率，組間比較用卡方檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

用Foxp3-3279 位點(diǎn)A 等位基因和位點(diǎn)C 等位基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可見(jiàn)大小約333 bp 和334 bp 片段，與預(yù)期目的基因片段大小相符。C 等位基因引物擴(kuò)增CC 基因型純合子，A 等位基因引物擴(kuò)增AA 基因型純合子，如果同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的基因型則判斷為AC 雜合子，PCR 電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。隨機(jī)選取PCR 電泳進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示:AC、AA 和CC 三種基因型與PCR 結(jié)果相符(見(jiàn)圖2)。

圖1 Foxp3 -3279 位點(diǎn)基因型PCR-ARMS 分析電泳圖

圖2 Foxp3 -3279 位點(diǎn)各基因型測(cè)序圖

表1 牙周炎和正常組Foxp3 -3279 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率n(%)

表1 的結(jié)果顯示:Foxp3 -3279 位點(diǎn)CC、CA、AA 三種基因型頻率在牙周炎患者中分別為74%，24%和2%;在正常對(duì)照中分別為72.82%，24.27%和2.91%，提示Foxp3 -3279 各位點(diǎn)基因型和等位基因在牙周炎組和正常組之間分布差異無(wú)顯著性。

4 討論

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周組織(牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì))的慢性炎癥性破壞性疾病。粘附著于牙齒或口腔組織的微生物，易形成牙菌斑，并且持續(xù)發(fā)展分泌許多炎性因子，導(dǎo)致正常組織的功能紊亂，表現(xiàn)為牙周炎患者外周血白細(xì)胞的功能缺陷，趨化能力降低、吞噬及殺菌能力下降、粘附功能升高，這些改變主要是由于炎癥細(xì)胞因子、地諾前列酮增多，白三烯β4、IL-10、TGF-β 和金屬蛋白酶等減少，提示適應(yīng)性免疫應(yīng)答在牙周炎的發(fā)病過(guò)程中起一定的作用。

Foxp3 是Fox(Forkhead box)家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，是X染色體上基因編碼的叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達(dá)于調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25+Treg 細(xì)胞)，并對(duì)其的分化、發(fā)育和功能維持有重要作用［1］。而表達(dá)Foxp3 的CD4 +CD25 +Treg 細(xì)胞可以抑制體外TCR 刺激下T 細(xì)胞活化和增殖。研究還發(fā)現(xiàn)Foxp3mRNA 在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的CD25 -和CD8 +細(xì)胞受到刺激后也可以表達(dá)Foxp3mRNA。人類FOXP3 基因存在多種突變，可引起免疫失調(diào)性基因疾病、多發(fā)性內(nèi)分泌腺體病、X-相關(guān)綜合癥(IPEX)等，故對(duì)于整體免疫失調(diào)的多種自身免疫性疾病來(lái)說(shuō)檢測(cè)CD4+CD25 +Treg 細(xì)胞上Foxp3mRNA 可直接反映體內(nèi)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的狀態(tài)。

牙周炎的病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜［2-4］，牙周炎的主要的病理改變是牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)合上皮附著喪失、牙周袋形成、牙槽脊頂開(kāi)始吸收及牙周膜間隙增寬。牙周組織受破壞這個(gè)改變的過(guò)程，涉及多項(xiàng)信號(hào)調(diào)控通路。研究認(rèn)為Th0 前體細(xì)胞向Th1/Th2 細(xì)胞分化過(guò)程中平衡失調(diào)，向Th1 細(xì)胞分化過(guò)度至其功能相對(duì)亢進(jìn)，Th1 型細(xì)胞因了可增加牙槽骨的吸收，而Th2 細(xì)胞分化較弱致其功能不足，Th2 型細(xì)胞因子對(duì)牙周組織有保護(hù)作用，認(rèn)為這改變與牙周病的發(fā)病密切相關(guān)。健康人正常牙齦組織中有一定數(shù)量CD4+CD25 +Treg 細(xì)胞，出現(xiàn)牙周炎時(shí)，其數(shù)量會(huì)減少，或者CD4 +CD25 +Treg 細(xì)胞數(shù)量不減少，但會(huì)有免疫功能障礙［5］，F(xiàn)oxp3 表達(dá)水平降低。牙周的CD4 +CD25 +Treg 細(xì)胞受細(xì)菌侵入刺激后分泌TGF-β、IL-10 等發(fā)揮抑制過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，防止組織破壞的病理性應(yīng)答的發(fā)生。而TGF-β可誘導(dǎo)T 細(xì)胞表達(dá)Foxp3，通過(guò)IL-2、IL-10 發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道［6］Foxp3 的mRNA 表達(dá)和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的在功能上是有關(guān)聯(lián)的，缺乏功能性Foxp3 基因會(huì)引發(fā)多種自身免疫性疾病，說(shuō)明Foxp3 在調(diào)控CD4 +CD25+Treg 細(xì)胞活化中起到重要的作用。Rudensky 等通過(guò)向小鼠注入CD4+CD25 +Treg 細(xì)胞可以預(yù)防淋巴細(xì)胞增生失調(diào)的發(fā)生，再證實(shí)了Foxp3 的缺失可導(dǎo)致CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的不足，進(jìn)而引起免疫功能失調(diào)。有人通過(guò)免疫組化和實(shí)時(shí)定量RT-PCR 證實(shí)了牙周炎患者Foxp3 表達(dá)存在下調(diào)現(xiàn)象［7］。這些研究表明牙周炎的患者存在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞抑制效應(yīng)的缺陷，由于產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子的效應(yīng)性CD4 +T 細(xì)胞和分泌抑炎性細(xì)胞因子的CD4 +CD25 +Treg 細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)之間的平衡出現(xiàn)異?？赡軐?dǎo)致Th2 細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)。然而體機(jī)如何調(diào)控效應(yīng)性細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞之間的平衡，目前還不清楚。Fontenot［8］研究表明Foxp3 在調(diào)節(jié)性細(xì)胞表達(dá)具有特異性，而Foxp3 基因編碼產(chǎn)物的功能缺失可造成CD4 +T 細(xì)胞相關(guān)淋巴細(xì)胞增生病。張青等［9］研究表明調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的改變與再生障礙性貧血密切相關(guān)。人類Foxp3 基因有多種突變，其中-3279 位點(diǎn)研究得較多，Zhang L 等［10］、馬秋茹等［11］和楊韶艷等［12］研究己發(fā)現(xiàn)Foxp3 -3279 基因多態(tài)性位點(diǎn)分別與過(guò)敏性鼻炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斑禿發(fā)病相關(guān)。我們也對(duì)牙周炎的Foxp3 基因-3279 位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，研究該基因是否與牙周炎的發(fā)病相關(guān)，但是結(jié)果表明牙周炎的Foxp3-3279 各基因型頻率和基因頻率與正常對(duì)照組相比，各等位基因無(wú)顯著性差異。提示牙周炎可能與Foxp3 -3279 基因多態(tài)性無(wú)關(guān)聯(lián)。牙周病發(fā)病率較高，是成人失牙的主要原因，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此有必要探究其他細(xì)胞因子的多態(tài)性位點(diǎn)及其它危險(xiǎn)因素，分析確定牙周炎致病機(jī)制，為該病的治療和預(yù)防提供依據(jù)。

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