鄭少峰 黃貴和 羅澤斌 黃楚君 劉瑞磊

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，Perou 和Sorlie 等［1-2］根據(jù)分子表型將乳腺癌分為5 類:Lumina1 A、Luminal B、Normal Breast Like、C - erB -2(HER2)及Basal - like 乳腺癌。這幾類乳腺癌在分子生物學(xué)特征、組織形態(tài)、免疫表型還是對(duì)治療的反應(yīng)上都存在著極大的差異。基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Basal-like 乳腺的表達(dá)譜特征為ER、PR 和HER2 這三種受體基因表達(dá)缺失，p53 表達(dá)，BRCA1 和P53 基因突變，而EGFR、Ki -67 和cyclin D 等細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)［3］，因此臨床上將ER、PR 和HER2 表達(dá)陰性的這類乳腺癌稱為三陰乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer，TNBC)。

TNBC 的臨床特征為原發(fā)腫瘤體積大，臨床分期晚，組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞增殖活性高和侵襲能力強(qiáng)。與其它類型的乳腺癌相比，TNBC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，易轉(zhuǎn)移至肺臟和肝臟等內(nèi)臟器官［4］。由于TNBC 缺乏內(nèi)分泌治療及針對(duì)HER2的分子靶向治療的相應(yīng)靶點(diǎn)，治療手段較為匱乏，預(yù)后生存較非TNBC 差［5］，成為乳腺癌治療中的難點(diǎn)。

雌激素在雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，ER 的表達(dá)狀況對(duì)判斷乳腺癌預(yù)后及指導(dǎo)乳腺癌的內(nèi)分泌治療具有重要意義。ERα 作為經(jīng)典的ER，通常認(rèn)為其陽性表達(dá)者預(yù)后較好，1997 年成功地克隆鑒定了第二個(gè)雌激素受體:ERβ 后，關(guān)于ERβ 對(duì)乳腺癌的作用和在內(nèi)分泌治療中的地位成為了新的研究熱點(diǎn)。

多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在多數(shù)ERα 陰性和三陰乳腺癌患者中仍有ERβ 表達(dá)。ERβ 與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移減少相關(guān)，是ERα 陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。在某些腫瘤的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ERβ 過表達(dá)已被證實(shí)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。那么ERβ對(duì)TNBC 細(xì)胞的增殖和凋亡是否存在影響呢?本研究將選用ERβ 低表達(dá)的TNBC 細(xì)胞株MDA -MB -435s，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，建立ERβ 穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株。觀察ERβ 對(duì)TNBC細(xì)胞增殖凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。以探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 經(jīng)患者知情同意，隨機(jī)選取中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2007 年1 月～2014 年10 月病理證實(shí)為TNBC行乳腺癌手術(shù)治療的手術(shù)標(biāo)本60 例，并取癌旁正常乳腺組織標(biāo)本60 例，年齡33 ～69 歲，中位年齡51.0 歲，患者全部為女性。

1.1. 2 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞系MDA -MB -435s 購自美國典型細(xì)胞培養(yǎng)庫(ATCC)。

1.1. 3 試劑 鼠抗人ERβ 單克隆抗體購自Abcome 公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone 公司，胰蛋白酶購自GIBCO 公司，Western blot 用兔抗人多克隆抗B -actin 抗體、羊抗兔和兔抗鼠二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶(BamH I 和Hind III)、T4 DNA 連接酶、dNTP等購自Fermentas 公司，DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM及Trizol 購自Invitrogen 公司，G418 等化學(xué)試劑購自Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)ERβ 在TNBC 患者腫瘤及癌旁組織中的表達(dá) 取經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊，4 μm 連續(xù)切片，烤片2 h 后經(jīng)二甲苯連續(xù)脫蠟三次。梯度酒精水化。EDTA 抗原修復(fù)后滴加3%過氧化氫，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS 漂洗后加一抗孵育過夜(4 ℃)，PBS 漂洗后加二抗，室溫下孵育45 min，DAB 室溫下顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。ERβ 陽性染色定位于細(xì)胞核。隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍視野，按陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)÷癌細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)算每個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞所占比例，取其平均值為該張切片的表達(dá)水平。ERβ 陽性細(xì)胞＞25%者記為為陽性，見圖1A，≤25%計(jì)為陰性，見圖1B。

圖1 ERβ 在TNBC 中的表達(dá)

1.2.2 pEGFP-C1/ERβ 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以Trizol 試劑法提取ERβ 陽性表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF - 7 總RNA。以總RNA 為模板，Oligo(dT)為引物，將mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用ERβ 引物(分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III 酶切位點(diǎn))擴(kuò)增出ERβ 序列。上游引物5' -GATGCTTTGGTTTGGGTGAT - 3'，下游引物5' - CTTGTTACTCGCATGCCT-3'。以限制性內(nèi)切酶BamH I 和Hind III消化PCR 產(chǎn)物，DNA 回收試劑盒回收目的片段，將ERβDNA片段插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化、回收的真核表達(dá)載體pEGFP-C1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 擴(kuò)增后，提取細(xì)菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定后送華大基因公司測(cè)序。成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C1 -ERβ。

1.2.3 pEGFP-C1/ERβ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s 以2 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板，以正常MDA - MB -435s 細(xì)胞為對(duì)照，按Lipofectamine2000TM操作說明書，分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1 (空質(zhì)粒)和pEGFP-C1 -ERβ。4 ～6 h 后，棄去轉(zhuǎn)染液，更換2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后以750 mg/L 的G418 的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，約16 d 后對(duì)照MDA -MB -435s細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組改用200 mg/L 的G418 的培養(yǎng)液，將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，建立穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.2.4 Western-blotting 法鑒定ERβ 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)

收集MDA-MB -435s -pEGFP -C1 -ERβ 細(xì)胞蛋白，將50 μg 樣本加在8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠孔中，80 V 電壓電泳跑膠，110 mA 電流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉封閉2 h(室溫)，洗膜后加入ERβ 單克隆抗體(1∶300)和β - actin(1∶500)，4 ℃條件下孵育過夜，復(fù)溫并洗滌后二抗孵育1 h(室溫)，用化學(xué)發(fā)光試劑盒Thermo 進(jìn)行曝光，電泳凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 將MDA-MB -435s、MDA -MB -435s -pEGFP -C1、MDA -MB -435s -pEGFP -C1 -ERβ 細(xì)胞以2 ×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，在恒溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養(yǎng)，設(shè)5 個(gè)平行孔。分別于第1 ～7 天加入100 μL 5 mg/mL 甲基噻唑基四唑(MTT)工作液，孵育4 h 后棄去上清，加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解MTT 還原物，震蕩15 min，用酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm 處的吸光度數(shù)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A490值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，評(píng)估細(xì)胞增殖情況。

1.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell 小室上室面加入50 μL 按比例混合的Matrigel 與DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-435s -pEGFP -C1 和MDA -MB -435s -pEGFP-C1 -ERβ 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，配成2 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，上室每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，用棉簽拭去Matrigel 膠。95%甲醇室溫下固定20 min，風(fēng)干，0.25%結(jié)晶紫染色，風(fēng)干后，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

1.4 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

按1∶1 比例將0.7% 瓊脂與2 ×DMEM 培養(yǎng)液按混合，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA -MB -435s -pEGFP -C1 和MDA-MB-435s-pEGFP-C1 -ERβ 細(xì)胞懸液，充分混勻，制成密度為2 ×103/mL 的混懸液，每孔1 mL 注入到含0.6%瓊脂的六孔板中，瓊脂凝固后，將六孔板置于恒溫37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 w。用0. 2% 的p-iodonitrotetrazolium violet 染色后置于顯微鏡下觀察集落形成并拍照。

2 結(jié)果

2.1 ERβ 在TNBC 患者腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)

60 例TNBC 組織標(biāo)本中，ERβ 陽性表達(dá)的為23 例(38.33%)，對(duì)應(yīng)60 例癌旁組織中ERβ 陽性表達(dá)的為31 例(51.67%)，顯著高于癌組織中的陽性表達(dá)率。

2.2 穩(wěn)定高表達(dá)ERβ 細(xì)胞株的篩選及鑒定

用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染ERβ 至人乳腺癌細(xì)胞株MDA -MB-435s 中，經(jīng)G418 篩選，并通過Western blotting 進(jìn)行鑒定。以親代細(xì)胞MDA - MB - 435s 和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞MDA-MB-435s -pEGFP -C1 作為對(duì)照。獲得ERβ 蛋白高表達(dá)克隆，見圖2。

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERβ 基因的MDA-MB-435s 細(xì)胞中ERβ 表達(dá)量增高

2.3 ERβ 抑制TNBC 細(xì)胞的生長(zhǎng)

通過MTT 法繪制三組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以觀察ERβ 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。與MDA-MB-435s 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞MDA-MB -435s -pEGFP -C1 相比，轉(zhuǎn)染ERβ 的MDA -MB-435s 細(xì)胞其生長(zhǎng)速度下降，見圖3。

2.4 ERβ 對(duì)TNBC 細(xì)胞侵襲能力的影響

通過計(jì)數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量來衡量細(xì)胞的侵襲能力。與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ERβ 的MDA -MB -435s 細(xì)胞穿過transwell 微孔膜的細(xì)胞數(shù)量明顯下降，細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，見圖4。

圖3 ERβ 的表達(dá)對(duì)MDA-MB-435s 細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 ERβ 的表達(dá)對(duì)MDA-MB-435s 細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 ERβ 對(duì)TNBC 細(xì)胞成瘤能力的影響

軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ERβ 的MDA-MB-435s 細(xì)胞形成的集落明顯減少，說明ERβ 可抑制TNBC 細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力。

3 討論

TNBC 好發(fā)于30 ～40 歲的絕經(jīng)前婦女、體質(zhì)量指數(shù)較高的絕經(jīng)前婦女、腰臀比較高的圍絕經(jīng)期女性，以及有乳癌家族史或BRCA1 基因突變失活的女性［6-8］。TNBC 的治療目前仍主要依靠化療，由于大多數(shù)TNBC 存在BRCA1 基因的突變，而體外研究證實(shí)鉑類藥物、絲裂霉素、依托泊苷和博來霉素等對(duì)BRCA1 基因突變的乳腺癌敏感［9］，所以有學(xué)者認(rèn)為大劑量化療能給TNBC 患者帶來更大的生存獲益［10］。在分子靶向治療方面，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)PARP(一種DNA 修復(fù)酶)可能是TNBC 新的治療靶點(diǎn)，而其它靶向藥物如貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin)西妥昔單抗(Cetuximab)等僅有小范圍的臨床試驗(yàn)［11-12］結(jié)果并不令人滿意?，F(xiàn)在針對(duì)TNBC的化療藥物和靶向治療藥物還無法在大樣本、前瞻性、多中心臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，同時(shí)還存在著副作用大或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，因此，尋找潛在有效的治療靶點(diǎn)，解決TNBC 治療效果不佳的難點(diǎn)，具有重要的意義。

人類ERβ 基因位于染色體14q23 -24.1，由530 個(gè)氨基酸構(gòu)成［13］。ERα 和ERβ 通常在大多數(shù)正常乳腺組織、乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞株中共同表達(dá)，但某些乳腺癌細(xì)胞只表達(dá)ERβ，也有乳腺癌細(xì)胞兩種受體都不表達(dá)［14］。ERβ 在許多ERα 陰性和TNBC 細(xì)胞中表達(dá)，提示ERβ 在雌激素信號(hào)通路和三陰乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。但是其表達(dá)水平的高低對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響還沒有定論，與相關(guān)生理病理指標(biāo)的關(guān)系以及它在臨床內(nèi)分泌治療中的地位還有很多不一致的結(jié)果。在非乳腺癌腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)ERβ 是一個(gè)重要的抑癌因子，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯減少［15］。ER除了通過與雌激素結(jié)合這種配體依賴性的方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯外，還可以在無雌激素作用時(shí)以配體非依賴性方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯［16］。在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中也觀察到ERβ以雌激素非依賴的方式抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡［17-19］。可見應(yīng)用各種ERβ 受體激動(dòng)劑或小干攏RNA 來研究ERβ 受體的作用，明確它所涉及的有關(guān)下游機(jī)制，在治療TNBC 的研究中具有很大的價(jià)值。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)ERβ 在TNBC 及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其在兩種組織中的表達(dá)差異，以及ERβ 高表達(dá)對(duì)TNBC 細(xì)胞的增殖、侵襲、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力的影響，研究表明，ERβ 過表達(dá)后，TNBC 細(xì)胞MDA -MB-435s 的增殖能力明顯下降，同時(shí)，穿膜能力和錨定非依賴性生長(zhǎng)能力均大幅度下降。以上研究結(jié)果表明，ERβ 的高表達(dá)可對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移起到抑制作用，在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，為TNBC 的基因治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，ERβ 的表達(dá)與TNBC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)缺失可能是TNBC 癌變過程中的早期事件。隨著對(duì)其功能研究的進(jìn)一步完善，ERβ 必將成為診斷和預(yù)測(cè)TNBC預(yù)后的分子標(biāo)志物和抗TNBC 侵襲和轉(zhuǎn)移的生物治療新靶點(diǎn)，為TNBC 的治療提供新的突破口。

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