曹 玉 ，朱堅磐(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院藥品所，江蘇 南京 10000;.浙江省疾病預(yù)防控制中心理化實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310051)

近年來，隨著人們生活水平的提高，對健康的要求也越來越高，保健食品市場也日益繁榮。粗多糖是保健食品中最常添加的功效成份之一，其防癌、提高免疫力、降低血脂和血糖、抗氧化、抗衰老的效果得到了廣泛的認(rèn)同［1-11］。很多植物如香菇、木耳、靈芝、枸杞等都含有粗多糖，但其分子成分卻不相同，采用不同的分析方法得出的結(jié)果會出現(xiàn)較大的差異。目前，粗多糖尚無國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，對不同的樣本采用科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法［12-16］，是保健品中有效成份粗多糖的分析技術(shù)的關(guān)鍵。本研究采用不同的前處理方法及顯色方法對同一樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果有顯著差異，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計，貝克曼公司生產(chǎn);DK 一600S 型恒溫水箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn);GS-6R 型離心機(jī)，貝克曼公司生產(chǎn)。

1.2 試藥

(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0. 500 0 g，加水溶解后，定容至50 ml，此液含葡萄糖10.00 mg/ml;(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:吸取以上標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml，加水定容至100 ml，此液含葡萄糖0.10 mg/ml;(3)50 g/L 苯酚溶液:稱取新鮮苯酚5.0 g，加水至100 ml 溶解，放置冰箱中;(4)糖化酶:250 g/瓶，活性10 萬/g，(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批準(zhǔn)文號:080318);(5)硫酸蒽酮試液:精密稱取蒽酮100 mg 置于燒杯中，加入75%硫酸100 ml 中(75 ml 濃硫酸加入25 ml 蒸餾水中)溶解，即得，然后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，臨用新配。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml(相 當(dāng) 于 葡 萄 糖0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg)，分別置于25 ml 比色管中，準(zhǔn)確加水至2 ml，加入苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸10 ml，混勻，沸水浴2 min，冷卻至室溫，485 nm 處1 cm 比色皿測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.1 試樣前處理方法一:取樣約1 g，加50 ml 蒸餾水溶解，沸水浴2 h，冷卻，定容，過濾，備用。準(zhǔn)確吸取濾樣5.0 ml 置于50 ml 離心管中，加入無水乙醇20 ml，混勻5 rain 后，以3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3 ～4 次。殘渣用水溶解并定容至10 ml，取1 ml 稀釋至5 ml，混勻后備用。取0.20 ml 樣品處理液于25 ml 比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至1 ml，同標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。根據(jù)結(jié)果計算:

注:C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得來的樣液中葡聚糖含量(g)。

2.1.2 試樣前處理方法二:取樣約1 g，加50 ml 蒸餾水溶解，超聲萃取2 h，冷卻，定容，過濾，備用，其余同2.1.1。

2.1.3 試樣前處理方法三:取樣約1 g，加50 ml 蒸餾水溶解，超聲萃取2 h，冷卻，定容，過濾后置于4 ℃下過夜后，備用，其余同2.1.1。

2.2 前處理方法的方法學(xué)比較

2.2.1 2 種方法精密度試驗(yàn):按不同前處理方法(2.1.1 與2.1.2)處理同一靈芝孢子粉中6 份樣液，分別測定其含量，見表1。2.2.2 2 種方法提取效果試驗(yàn):按不同前處理方法(2.1.1 與2.1.2)處理同一靈芝孢子粉中6 份樣液，分別測定其含量，見表1。

表1 2 種方法測定破壁靈芝孢子粉中粗多糖含量的比較(%)Tab 1 Comparison of determination of crude polysaccaride content in sporoderm-broken spore powder of two methods(%)

2.3 烏藥精粉精密度試驗(yàn)及提取效果試驗(yàn)結(jié)果

烏藥精粉采用2.1.1 前處理方式，方法RSD% =1.205，樣本含量平均值為2.607%;烏藥精粉采用2.1.2 前處理方式，方法RSD% =8.409，樣本含量平均值為1.765%。結(jié)果顯示:沸水浴2 h，樣本含量的精密度和提取效果均較超聲效果好。

2.3.1 2 種方法的精密度試驗(yàn):按不同前處理方法(2.1.1 與2.1.3)處理同一烏藥精粉中6 份樣液，分別按法測定其含量，見表2。

2.3.2 2 種方法的提取效果試驗(yàn):按不同前處理方法(2.1.1與2.1.3)處理同一烏藥精粉中粉中6 份樣液，分別按法測定其含量，見表2。

2.4 破壁靈芝孢子粉精密度試驗(yàn)及提取效果試驗(yàn)結(jié)果

破壁靈芝孢子粉采用2.1.1 前處理方式，方法RSD% =6.671，樣本含量平均值為12.992%;破壁靈芝孢子粉采用2.1.3 前處理方式，方法RSD% =0.760，樣本含量平均值為10.308%。結(jié)果顯示，采用2.1.3前處理方式的提取效果優(yōu)于采用2.1.1 前處理方式，可見沸水浴2 h 提取效率優(yōu)于超聲的提取效率。

表2 2 種方法測定烏藥精粉中粗多糖含量的比較(%)Tab 2 Comparison of determination of crude polysaccaride content in lindera aggregata flavor powder of two methods (%)

2.5 不同顯色方式的方法學(xué)比較

2.5.1 2 種顯色法:(1)苯酚硫酸顯色法:見2.1.1。(2)蒽酮硫酸顯色法:準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml(相當(dāng)于葡萄糖0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg)，用刻度吸管補(bǔ)蒸餾水至2.00 ml，搖勻，分別于冰水浴中滴加2 g/L 蒽酮硫酸試劑5 ml，注意保持混合物冷卻，加完后密封，搖勻，于沸水浴中加熱10 min，迅速置冷水浴冷卻10 min 后，以首管為空白于625.80 nm 測吸光度。

2.5.2 2 種顯色法測定樣本中粗多糖含量的比較:在2.1.1前處理方法下，分別采用苯酚硫酸顯色法和蒽酮硫酸顯色法測定樣品，見表3。結(jié)果表明，2 種顯色方式對測定結(jié)果無明顯差異。

表3 2 種顯色法測定樣本中粗多糖含量的比較(%)Tab 3 Comparison of determination of crude polysaccaride content in different samples between two kinds of colorimetric methods(%)

3 討論

3.1 不同顯色法比較

苯酚硫酸顯色法和蒽酮硫酸顯色法所測粗多糖線性、穩(wěn)定性較好，是目前測定多糖較為理想的方法，操作簡便，穩(wěn)定可靠，適合大多數(shù)樣本中多糖的常規(guī)檢測，且不需要精密儀器，適用基層單位使用。苯酚硫酸顯色法測定多糖的含量，關(guān)鍵在于要將原同體苯酚重新蒸餾，去除其中被氧化的醌類等雜質(zhì)，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性;而蒽酮硫酸顯色法中，由于蒽酮在空氣中易變質(zhì)，故溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用;由于其對溫度較敏感，大約加熱10 min 左右，作出曲線線性較好。以上2 種方法均需用到冰水浴迅速降溫，以減少副產(chǎn)物的形成。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，濃硫酸的加入方式對試驗(yàn)的結(jié)果有影響，采取移液管懸空，垂直加人濃硫酸，立即搖勻的方式，顏色反應(yīng)充分，顯色結(jié)果穩(wěn)定，故在測定中應(yīng)避光或迅速操作，以獲得理想的重現(xiàn)性。

3.2 不同前處理方法比較

不同樣本需要用不同的前處理手段，在破壁靈芝孢子粉中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)4 ℃靜置的樣本，明顯渾濁，可能含有與多糖相近性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)入，造成試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，故需在測定樣本前，多做預(yù)試驗(yàn)。

［1］ 張換，曾艷，管于平，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多糖的酶法提取工藝及其抗氧化研究［J］.食品科技，2013，38(5):197-202.

［2］ 尚曉婭，欽傳光，曹剛，等.絞股藍(lán)多糖提取分離、化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的研究進(jìn)展［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22(3):514-518，540.

［3］ 張黎，楊艷. 茶多糖藥理活性研究進(jìn)展［J］. 中國實(shí)用醫(yī)藥，2013，8(16):255-257.

［4］ 王秀娟，梁久偉，詹冬玲.海帶多糖飲料的研制［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33(7):93-95.

［5］ 李新明，張永茂，熊善柏.紅棗多糖飲料的研制［J］.糧油食品科技，2012，20(1):46-47，64.

［6］ 梁靜，劉曉宇，鄧碧云，等.紅棗粗多糖的提取及抗氧化活性評價［J］.食品科技，2012，37(1):177-181.

［7］ 方麗.菊花多糖飲料的研制［J］. 中國食物與營養(yǎng)，2010，6(9):53-55.

［8］ 朱亮，石海春，羅強(qiáng)，等.玉米須多糖的提取、組成和生物活性研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2013，50(3):631-637.

［9］ 周桃英，袁仲，崔東波.蓮藕多糖保健飲料抗疲勞活性試驗(yàn)研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(1):329-330.

［10］ 陳剛，郭曉蕾，寶麗.銀耳、麥冬、燕麥多糖的抗氧化活性及吸濕保濕性能研究［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(1):212-214.

［11］ 劉洋洋，安瑩瑩，秦文娟，等.黃精多糖藥理作用研究進(jìn)展［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35(9):967-970.

［12］ 劉丹.對多糖測定方法的探討［J］. 四川文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，18(2):49-51.

［13］ 王燕萍，楊君，馮慧予，等. 粗多糖測定方法的選擇對分析結(jié)果的影響［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(9):2171-2174.

［14］ 黃東萍，文東旭，林文翰.天芎注射液中多糖的含量測定［J］.華西藥學(xué)雜志，2005，20(2):167-168.

［15］ 何永超，劉雅敏，朱艷慧，等.苯酚-硫酸顯色法測定炙甘草湯的總多糖含量研究［J］.中醫(yī)學(xué)報，2013，28(4):547-549.

［16］ 韓江偉，楊夏，孫麗君，等. 奶制瑞香狼毒中多糖含量的蒽酮-硫酸法測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(6):1332-1333.