蔚鵬飛 周 意 張志華 何 偉 魯 藝 屠 潔

(中國科學院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

用于光遺傳技術(shù)的體外細胞光刺激系統(tǒng)

蔚鵬飛 周 意 張志華 何 偉 魯 藝 屠 潔

(中國科學院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

光遺傳技術(shù)具有在毫秒水平上精細調(diào)控某種特定細胞亞群活性的優(yōu)勢，對神經(jīng)回路和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和干預治療等基礎(chǔ)研究提供了一個嶄新的生物工程學工具。文章基于光遺傳技術(shù)的特點，研發(fā)了一套針對光感基因改造過體外培養(yǎng)細胞與離體腦片 LED 光刺激系統(tǒng)，實現(xiàn)遠程無線控制 LED 整列的刺激時間、頻率、占空比等參數(shù)，并同步檢測培養(yǎng)細胞的理化特性。

LED；光刺激；光遺傳技術(shù)

1 引 言

隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展和社會競爭壓力的增加，各種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病率也快速增加。精神疾病已經(jīng)成為一類嚴重影響中國民眾身心健康的疾病，給患者的家屬以及整個國家和社會帶來沉重的負擔。而且目前這些疾病的發(fā)病機制尚不明確，干預和治療手段有限。傳統(tǒng)的藥物治療是神經(jīng)精神疾病治療的重要方法。雖然通過藥物治療，部分病人的癥狀可以得到緩解，但是 10%左右的精神病病人通過 2 年甚至 5 年的藥物治療后并不能有效地控制疾病的發(fā)生[1]。

神經(jīng)調(diào)節(jié)技術(shù)是一種可逆的治療方式，主要利用電、磁或光刺激等改變大腦特定神經(jīng)回路的活性來達到治療疾病的目的。目前，有三種主要的神經(jīng)調(diào)節(jié)技術(shù)可對機體細胞進行神經(jīng)干預與調(diào)節(jié)，包括深部腦刺激(Deep Brain Stimulation，DBS)、經(jīng)顱磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation，TMS)和光遺傳技術(shù)(Optogenetics)。

DBS 本質(zhì)上是一種電刺激過程，臨床上應用電極刺激神經(jīng)中樞相應部位，對某些癲癇[2]和帕金森氏病[3,4]等疾病有一定的治療作用。但 DBS本身由于缺乏細胞特異性而會有副作用；另外，由于神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘢痕形成導致電極絕緣，治療作用只能持續(xù)幾個月到幾年；再者，DBS 對某些疾病治療作用的機制尚不清楚。

TMS 通過電場去極化興奮神經(jīng)細胞而起到治療作用，可用于治療精神分裂癥[5]、帕金森氏病[6]、重度抑郁癥[7]、中風[8]、慢性疼痛[9]等神經(jīng)精神疾病。但是 TMS 只能刺激大腦表面幾厘米范圍，無法刺激深部神經(jīng)元。同 DBS 一樣，TMS 也不能實現(xiàn)抑制神經(jīng)元和對特定細胞亞型進行特異性刺激。

光遺傳技術(shù)基于基因治療的方法，利用病毒載體將光敏感通道或泵蛋白基因?qū)肽骋惶囟ǖ募毎麃喨褐斜磉_。其中一種光敏感型通道蛋白(Channelrhodopsin-2，ChR2) 對藍光敏感，藍光可激活該通道，而使 Na+、K+等陽離子進入細胞內(nèi)而興奮細胞；另一種氯離子蛋白(Halorhodopsin，NphR)對黃光敏感，黃光將使Cl－進入細胞而抑制細胞[10,11]。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)藥理學工具或電刺激等模式缺乏細胞選擇性的缺點，相比其他形式的刺激具有更高時空分辨率。

體外人工神經(jīng)網(wǎng)絡的建立及其傳遞規(guī)律的解析是認識腦網(wǎng)絡和腦功能常用的研究方式，但傳統(tǒng)上給予體外培養(yǎng)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡實施干預的方法，往往缺乏高時空的精準。因此基于光遺傳技術(shù)具有細胞類型選擇特異性、高時空精準的優(yōu)勢，我們希望將該技術(shù)應用于對體外培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡調(diào)控的研究中。但是由于目前在腦片膜片鉗系統(tǒng)或在體植入式光刺激系統(tǒng)中，一般是應用基于光纖的點光源刺激方式，而缺乏為體外神經(jīng)培養(yǎng)裝置使用的光刺激設(shè)備。因此本文設(shè)計了一套基于 LED 光刺激系統(tǒng)用于經(jīng)過光敏感基因改造過的體外培養(yǎng)細胞。本刺激系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn) 473 nm 藍光和 588 nm 黃光兩種特定波長的光刺激，結(jié)合化學傳感器，可以同步檢測刺激中培養(yǎng)細胞理化性質(zhì)的變化。該裝置能夠根據(jù)實驗需求靈活地調(diào)節(jié)光強、刺激頻率、占空比、時間等技術(shù)參數(shù)，并能實時監(jiān)測培養(yǎng)皿的溫度、光強、pH 值、光照時間等信息。通過無線模塊和上位機連接，可以遠程無線地設(shè)計不同的刺激模式，并實時將當前刺激參數(shù)和檢測到的培養(yǎng)裝置內(nèi)的理化信息顯示出來。此外，本裝置還配備良好的散熱裝置，保證培養(yǎng)皿內(nèi)溫度不會過高，使研究實驗順利進行。

2 系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)

我們希望設(shè)計一套可以應用在體外細胞培養(yǎng)設(shè)備上的光刺激系統(tǒng)，該刺激系統(tǒng)主要需要達到的幾點重要技術(shù)指標包括：

(1)使用時間：保證連續(xù)光刺激工作時系統(tǒng)的穩(wěn)定，即連續(xù)工作 2 小時以內(nèi)光強不會顯著衰減。這一點主要是由于細胞培養(yǎng)環(huán)境一般是封閉的，而對于一些慢性、定時給予刺激的實驗，需要光刺激設(shè)備可以長時間獨立工作，因此要保證其光強的穩(wěn)定性。

(2)溫度：光刺激有可能造成培養(yǎng)器局部溫度的升高而影響培養(yǎng)細胞的生存，因此需要設(shè)計局部實時散熱的方法。

(3)光照強度：根據(jù)前人實驗，光遺傳學刺激神經(jīng)細胞時到達細胞表面的平均激發(fā)光強應不低于 1 mW/mm2。因此我們需要對光源進行設(shè)計，保證到達培養(yǎng)皿底部的平均光強是均勻分布，并且足夠激發(fā)神經(jīng)細胞活動。

(4)刺激模式：為了利用高時空精準的光刺激對體外神經(jīng)網(wǎng)絡的編碼規(guī)律進行調(diào)控，我們需要實現(xiàn)對刺激脈沖頻率、脈寬、個數(shù)任意連續(xù)控制和可調(diào)；同時為了避免培養(yǎng)的細胞受到污染，對刺激參數(shù)的控制應該可以無線完成。

刺激系統(tǒng)主要分為上位機和下位機兩部分(見圖 1)。其中，上位機部分是 LED 光刺激系統(tǒng)的軟件和操作部分，可以根據(jù)實驗需要設(shè)定不同的刺激模式參數(shù)；下位機部分是 LED 光刺激系統(tǒng)硬件部分，主要功能是接受上位機發(fā)送過來的刺激模式參數(shù)并通過下位機實現(xiàn)該參數(shù)模式下LED 陣列的控制。上位機與下位機之間通過無線傳輸模塊實現(xiàn)實時全雙工通信。

圖 1 系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)Fig. 1 The schematic representation of the structure of light stimulation system

2.1 上位機的設(shè)計與實現(xiàn)

上位機部分主要包括 PC 機、無線通訊模塊、參數(shù)設(shè)置界面軟件 3 部分(見圖 2)。其中，參數(shù)設(shè)置界面軟件是基于 LabView 設(shè)計的，可以按照實驗需求設(shè)置不同的刺激模式，并將運行狀態(tài)顯示出來。

圖 2 上位機軟件界面和無線通訊模塊Fig. 2 Software interface and the module of wireless communication

參數(shù)設(shè)置界面軟件主要有刺激模式設(shè)置模塊、運行狀態(tài)顯示模塊和運行參數(shù)保存模塊。這些可供選擇的刺激參數(shù)包括孔板選擇面板、運行參數(shù)設(shè)置面板。其中，孔板可以選擇六孔板培養(yǎng)皿中的一個或者多個孔板。運行參數(shù)設(shè)置面板可供實驗人員設(shè)計各種不同的刺激模式，可以設(shè)定單一的刺激模式，也可以設(shè)定多種刺激模式的疊加。這些刺激模式參數(shù)包括刺激頻率(Hz)、占空比(%)、刺激時間(s)、是否散熱(Y/N)、暫停時間(s)。其中，散熱是通過 LED 電路板上散熱片結(jié)合風扇的啟動來實現(xiàn)的。這些刺激參數(shù)可以在光刺激系統(tǒng)開始工作之前預先設(shè)定好，也可以在實驗過程中進行設(shè)計和更改，通過無限通訊模塊傳到下位機上。運行參數(shù)保存模塊主要是保存實驗過程中的刺激模式參數(shù)。運行狀態(tài)顯示模塊除了可以顯示當前運行狀態(tài)光刺激的頻率、占空比、已運行時間和剩余運行時間外，還可以結(jié)合其他物理和化學傳感器顯示其他培養(yǎng)細胞的理化特性。

2.2 下位機的設(shè)計與實現(xiàn)

下位機部分是 LED 光刺激系統(tǒng)的硬件部分，主要包括主控模塊、光源驅(qū)動模塊、LED 光源陣列、無線通訊模塊、傳感器檢測模塊、供電模塊、散熱模塊等部分組成(見圖 3)。下位機主要實現(xiàn)按照上位機預先設(shè)定好的刺激模式，控制LED 陣列的閃爍。

圖 3 下位機部分的主要模塊Fig. 3 The major components of the light stimulation

主控模塊是通過 51 單片機來實現(xiàn)的，將上位機發(fā)送過來的刺激模式參數(shù)，轉(zhuǎn)換成電脈沖序列信號。光源驅(qū)動模塊是通過三極管的放大作用來驅(qū)動NUD4001 恒流芯片實現(xiàn) LED 按照設(shè)定的頻率和占空比閃爍。LED 光源陣列上有 6 組，每組 9 個，一共 54 個 LED 燈來實現(xiàn)對六孔板中不同培養(yǎng)皿中細胞的獨立光刺激。無線通訊模塊式通過 2.4 G 高速無線串口透傳模塊實現(xiàn)，無線傳輸距離在 10 m 左右。由于刺激實驗需要在隔離的恒溫箱中進行，這樣的無線操作方式可以有效避免細胞受到污染的可能。下位機部分中的無線模塊式主要功能是接受上位機部分無線模塊發(fā)送過來的刺激模式參數(shù)，并且將下位機中檢測到培養(yǎng)細胞的溫度、pH 值、光強等理化性質(zhì)傳給上位機顯示出來。傳感器模塊主要是用來檢測光刺激過程中培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞的理化特征參數(shù)，保證細胞處在正常適宜的環(huán)境中生長。供電模塊是通過大容量的可充電鋰電池來實現(xiàn)供電的，可以保證實現(xiàn)對培養(yǎng)細胞的長時間光刺激。散熱模塊主要包括散熱片和散熱風扇兩部分，將大功率 LED 照射產(chǎn)生的熱量排走，避免因散熱不良導致培養(yǎng)細胞的溫度過高而影響其正常生長。

3 系統(tǒng)工作的參數(shù)實測

本文中的光刺激系統(tǒng)可以實現(xiàn)對 LED 陣列工作在 1～99 Hz 頻率范圍，占空在 1%～99% 范圍內(nèi)的遠程無線的連續(xù)可調(diào)。本系統(tǒng)可以用于6、24、96 孔板以及微電極陣列(Microelectrode Array，MEA)等體外細胞培養(yǎng)裝置。對幾個主要參數(shù)的實測結(jié)果如下(所有的實驗測試均在 6 臺樣機中進行并取平均結(jié)果)：

(1)使用時間：樣機進行 20 Hz 連續(xù)脈充藍光刺激，每間隔 15 min 對其輸出光強進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)直到 120 min 左右輸出光強仍能穩(wěn)定維持在初始光強的 90%(見圖 4)。而一般的普通固態(tài)激光光源連續(xù)啟動 1 h 后的光強浮動可達30% 以上。

圖 4 光強隨時間的變化率Fig. 4 The changing rate of light intensity over time

(2)使用溫度：對溫度的控制是使用該刺激器進行分子生物學實驗一個至關(guān)重要的因素。由于連續(xù)的光照會使培養(yǎng)皿受照射局部短時間積累較高的溫度，即使在恒溫箱中使用該設(shè)備，在連續(xù)使用 60 min 后培養(yǎng)皿底部溫度會上升至40℃，破壞了細胞外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。我們通過設(shè)計程控的風扇散熱裝置，使得溫度快速從局部釋放，結(jié)果顯示在連續(xù)使用 120 min 后局部溫度仍可維持在 38℃(見圖 5)。

(3)光照強度：由于希望給予整個培養(yǎng)皿均勻強度的光刺激，我們設(shè)計了一種 LED 陣列排布的方式避免了單一光源導致的強度不均勻(圖6(a))。在培養(yǎng)皿中心、側(cè)面以及邊緣三個位置分別測量光強(圖 6(b))，得到的結(jié)果顯示三個點的光強強度都可達到 2 mW/mm2以上并且沒有顯著差異(P＞0.5, t 檢驗)(圖 6(c))，完全滿足光遺傳學實驗對激發(fā)光強度的限制。

(4)刺激模式：對該光刺激系統(tǒng)的輸出刺激頻率，與通過示波器測量得到的參數(shù)相比較，得到在不同刺激頻率和占空比等參數(shù)下的誤差結(jié)果(圖 7)：在整個 1～99 Hz 范圍內(nèi)，本光刺激系統(tǒng)的輸出頻率誤差都在 6% 以內(nèi)；在 50 Hz 以內(nèi)光刺激系統(tǒng)的輸出頻率值都比較穩(wěn)定，誤差百分比的方差較小；隨著刺激頻率的增加，本系統(tǒng)的輸出頻率誤差增大，輸出頻率值波動變大。

圖5 培養(yǎng)皿溫度隨時間的變化Fig. 5 The changing rate of temperature in the dishes over time

圖 6 (a)陣列式 LED 布局設(shè)計；(b)光強測試點；(c)測試結(jié)果Fig. 6 (a) Layout of LED arrays; (b) Testing points of light density in the dish; (c) Testing result

圖 7 不同頻率的輸出誤差Fig. 7 Errors of different output frequencies

4 系統(tǒng)與活體腦片記錄結(jié)合

將此光刺激設(shè)備與活體腦片微電極陣列MEA 細胞外電活動記錄技術(shù)相結(jié)合，刺激攜帶光感基因的離體腦片細胞，可以記錄到由光照激活的神經(jīng)元電活動。MEA 技術(shù)可以無創(chuàng)性地記錄細胞的電活動，該 8×8 的記錄電極陣列由 60個間隔 200 μm 記錄電極組成[12]。其電極分布如圖 8 所示。MEA 記錄系統(tǒng)可記錄攜帶光感基因的離體腦片細胞自發(fā)的電活動信號和由光刺激產(chǎn)生的誘發(fā)神經(jīng)元電活動信號。由此，我們開發(fā)研制的用于光遺傳技術(shù)體外細胞光刺激系統(tǒng)可以有效地誘發(fā)出攜帶光感基因神經(jīng)元的電活動，證明了該設(shè)刺激設(shè)備的有效性。

圖 8 (a)MEA 電極記錄示意圖；(b)光刺激系統(tǒng)刺激攜帶光感基因的離體腦片；(c)由光刺激系統(tǒng)誘發(fā)的神經(jīng)元電活動Fig. 8 (a) The sample of MEA recording; (b) Stimulating the brain slice infected by ChR2 with light stimulation system; (c) Light activated neural activities

5 系統(tǒng)實際應用舉例

以本研究組最近發(fā)表的兩項工作為例(見圖9)：(1)楊帆博士等[13]應用該系統(tǒng)率先開展了應用光刺激調(diào)控皮下和原位顱腔神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的研究，通過精確光控膠質(zhì)瘤細胞膜電生理特性，選擇性地降低病變細胞的存活率。進一步通過模型小鼠活體水平的光調(diào)控研究，以及在人源膠質(zhì)瘤細胞中的檢測，證實了這種方法的有效性。(2)在另一項由屠潔博士等[14]展開的研究中，將光感基因以膠質(zhì)細胞特異性啟動子 GFAP 的控制下制備光敏型星型膠質(zhì)細胞，光特異性調(diào)控膠質(zhì)細胞能促進間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)往神經(jīng)元方向的分化。在體大鼠腦卒中模型證實光特異性調(diào)控光敏膠質(zhì)細胞后，能促進其周圍 MSCs 的神經(jīng)元分化，提高腦卒中大鼠的神經(jīng)功能修復。

圖 9 體外細胞光刺激系統(tǒng)工作圖Fig. 9 The samples of in vitro cell culture light stimulation device

6 總 結(jié)

本文設(shè)計和實現(xiàn)了一種基于光敏感基因改造過的體外培養(yǎng)細胞光刺激系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)遠程、無線遙控來設(shè)置不同的光刺激模式，并能夠?qū)崟r動態(tài)地檢測和顯示體外培養(yǎng)細胞所處的理化狀態(tài)。該系統(tǒng)可以廣泛地用于光遺傳技術(shù)領(lǐng)域的體外細胞培養(yǎng)中的光刺激，調(diào)控其功能，對于一些神經(jīng)環(huán)路的研究和一些神經(jīng)精神疾病的研究提供了一種有力的工具。

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In Vitro Cell Culture Light Stimulation System for Optogenetics

WEI Pengfei ZHOU Yi ZHANG Zhihua HE Wei LU Yi TU Jie

(Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

Optogenetics technology has the advantage of regulating the activity of specific cell population in milliseconds level, which provides a novel bioengineering tools for understanding the mechanism of the neural circuits and the pathogenesis of some neurological diseases and interventions treatment. Based on the characteristics of optogenetics, we developed a set of LED light stimulation system for optogenetics modified in vitro cell culture or brain slice. This device can remotely control stimulation parameters of LED arrays such as time, frequency, duty cycle, and simultaneously detect physicochemical properties of cultured cells.

LED; light stimulation; optogenetics

TP 391

A

2014-06-03

：2015-03-19

國家科技支撐計劃(2012BAI01B08)

蔚鵬飛(通訊作者)，博士，助理研究員，研究方向為神經(jīng)信息編碼技術(shù)，E-mail：pf.wei@siat.ac.cn；周意，碩士，研究方向為生物醫(yī)學信號處理；張志華，本科生，研究方向為醫(yī)療器械硬件研發(fā)；何偉，碩士，研究方向為神經(jīng)信息編碼技術(shù)；魯藝，副研究員，研究方向為為光遺傳技術(shù)開發(fā)及其在神經(jīng)精神疾病研究中的應用；屠潔，副研究員，研究方向為異常神經(jīng)回路的調(diào)控研究。