戴永輝陳 坦王戰(zhàn)會

1(廣東省中醫(yī)院檢驗科 廣州 510120)

2(天津微納芯科技有限公司 天津 300457)

3(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

一種離心式微流控生化分析芯片

戴永輝1陳 坦2王戰(zhàn)會3

1(廣東省中醫(yī)院檢驗科 廣州 510120)

2(天津微納芯科技有限公司 天津 300457)

3(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

文章介紹了一種低成本、快速、自動化的離心式微流控生化分析芯片。該芯片通過整合樣本前處理和多生化指標(biāo)檢測，采用了多級微流道與虹吸微閥相結(jié)合的方式把樣本的前處理、樣本輸送、樣本與生化試劑反應(yīng)等過程集成于一體，并通過比色檢測獲得各個生化檢測項目的結(jié)果。實驗結(jié)果顯示芯片比色孔光程的精密度的變異系數(shù)在 0.08%～0.52%，通過血糖結(jié)果的精密度評估的芯片對樣本和稀釋液定量以及兩者混合的精密度變異系數(shù)為 1.4%，同時使用芯片測定 15 個生化項目的日間和批內(nèi)精密度均小于 3.5%，這表明該離心式微流控生化分析芯片符合臨床檢測要求。

微流控芯片；生化分析；床旁診斷

1 引 言

近年來微流控芯片技術(shù)迅速發(fā)展，微流控分析芯片已經(jīng)開始從基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段進(jìn)入深度產(chǎn)業(yè)化及市場開發(fā)階段[1,2]。微流控芯片技術(shù)具有消耗試劑少、檢測速度快、容易集成等優(yōu)點[3,4]。微流控芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，促進(jìn)了即時檢驗(Point-of-Care Testing，POCT)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。1995 年，在加利福尼亞召開的美國臨床化學(xué)協(xié)會年會展覽會上辟出一個特殊的展區(qū)，專門展示最新 POCT 技術(shù)與設(shè)備，帶給所有參觀者以嶄新的概念。2006 年中國 POCT 委員會籌建，2007 年起中國 POCT 高峰論壇每年舉辦一次。中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會主任委員叢玉隆教授認(rèn)為：“在未來 5～10 年內(nèi)，POCT 應(yīng)該達(dá)到檢查方法的 70%～80%，基本改變目前的檢驗格局”。

POCT 技術(shù)的發(fā)展使其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，從最初的隱血、血糖、尿糖檢測發(fā)展到醫(yī)學(xué)檢驗的各個方面[5-8]。POCT 快速便捷，能隨時隨地對患者進(jìn)行檢測，且一般只需少量樣本即可在數(shù)分鐘內(nèi)獲得檢測結(jié)果。檢測時間短，可快速報告結(jié)果，極大地方便了患者和一些特殊人群的需要，尤其重要的是能夠?qū)痹\的危重患者實施更加及時地?fù)尵群椭委焄2,6]。POCT 診斷的一個重要發(fā)展方向是整合取樣、檢測、校準(zhǔn)和報告于一體的微型化、集成化的芯片實驗室技術(shù)[9]。微流控分析芯片已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生化分析、免疫分析、蛋白分析以及核酸檢測等臨床檢測的各個方面。在生化檢測方面，Lee 等[6]研制的生化及免疫分析微流控分析芯片實現(xiàn)了對相關(guān)項目的快速、低成本檢測；方群等[10]研制了一種激光誘導(dǎo)熒光檢測微流控分析芯片也實現(xiàn)了對有關(guān)項目的便捷、低成本檢測。但這兩款芯片都尚未進(jìn)行相關(guān)的臨床應(yīng)用研究。在本研究中，操作者將待測樣本添加到試劑芯片中，并將其置于 Celercare M1 分析儀上進(jìn)行檢測。通過毛細(xì)管作用和檢測芯片轉(zhuǎn)動時的離心力，芯片會將未計量的血液樣本轉(zhuǎn)換成多等份精確稀釋的血漿，并通過反應(yīng)孔的光學(xué)檢測同時進(jìn)行多種化學(xué)成分的分析。本研究從芯片檢測原理、臨床項目檢測等方面來探討該微流控分析芯片臨床應(yīng)用的可行性。

2 材料和方法

2.1 生化分析芯片

檢測芯片是一種直徑為 7 cm 且包含檢測所需的凍干試劑的一次性使用芯片。該芯片由兩個注塑成型的塑料部件通過超聲焊接而成。芯片基底和上蓋均由聚甲基丙烯酸甲酯塑料經(jīng)模塑成型制成。經(jīng)焊接的基體和上蓋構(gòu)成的芯片包括樣本槽、稀釋液槽、定量槽、混合槽、廢液槽、液流通道以及比色孔等結(jié)構(gòu)(如圖 1)，它們可對液體進(jìn)行處理控制。

圖 1 檢測芯片F(xiàn)ig. 1 Microfluidic chip for assay

每個模塑生產(chǎn)的試劑芯片中包含 30 個圓柱形小孔，小孔中可存放凍干試劑小球，樣本進(jìn)入小孔之后發(fā)生生化反應(yīng)，檢測時小孔作為比色孔使用。每個芯片包含 23 個能填充稀釋血漿的反應(yīng)比色孔和 4 個填充稀釋液的比色孔。反應(yīng)比色孔有 6 種不同的深度，分別為 0.5 mm、1.7 mm、2.1 mm、3.1 mm、4.3 mm 和 5.0 mm，以適應(yīng)不同試劑的敏感性和分析物的濃度。在生產(chǎn)試劑芯片時，將各生化檢測項目相應(yīng)的凍干試劑裝入芯片的比色孔中。

2.2 芯片檢測過程

使用該芯片進(jìn)行檢測時，無需對樣本進(jìn)行離心等預(yù)處理即可進(jìn)行檢測，因而血清、血漿或全血都可用于檢測。通常經(jīng)靜脈穿刺獲得全血樣本可在采集后 60 min 內(nèi)進(jìn)行分析，而指尖末梢血樣本則應(yīng)在采集后立即進(jìn)行分析。使用移液器將樣本和稀釋液分別經(jīng)芯片的樣本孔和稀釋液孔加入至芯片的樣本槽和稀釋液槽中。 其中，檢測所用的稀釋液為蒸餾水。添加樣本和稀釋液時操作者不必準(zhǔn)確計量樣本：通常最少需添加 90 μL 樣本和 450 μL 稀釋液，最多可向芯片中添加 120 μL樣本和 600 μL稀釋液，如圖 2。

圖 2 加入樣本(紅色)和稀釋液(藍(lán)色)Fig. 2 Adding sample (red) and diluent (blue)

加樣后操作者可將芯片放入 Celercare M1 分析儀的檢測倉中。檢測倉關(guān)閉，芯片裝載至分析儀主軸上固定，接下來儀器會對樣本和稀釋液進(jìn)行處理。分析開始時，分析儀會使芯片沿逆時針方向加速至 5000 rpm，并以該速度保持 2 min。離心力會使稀釋液從稀釋液槽進(jìn)入稀釋液定量槽。該定量槽徑向最外側(cè)的微流通道使稀釋液以受控的方式填充該定量槽。325.75 μL 稀釋液即可完全填充稀釋液定量槽。剩余的稀釋液會溢出稀釋液定量槽，并經(jīng)通道順序填充 4 個比色孔，而最終剩下的稀釋液則流入與芯片的其余部分隔離的廢液槽中。這 4 個比色孔用于內(nèi)部芯片的質(zhì)量控制。

在稀釋液定量的同時，離心力會使樣本流出樣本槽，并經(jīng)芯片上的 U 形微流通道流入樣本定量槽。完全充滿樣本定量槽需要 17.5 μL 樣本，其余樣本將溢流進(jìn)入“樣本充足”比色孔中。多余的樣本則會被阻隔在分離的樣本廢液槽中。如果在“樣本充足”比色孔中沒有檢測到樣本，則檢測分析會因樣本量不足而中止；如果所添加的樣本為全血，則通過離心力，可使樣本定量槽中定量的全血的血漿和紅細(xì)胞分隔開來。大多數(shù)樣本僅需 30 s 即可被充分分離。為了提供檢測所需的 20 μL 左右的澄清血漿，血細(xì)胞比容更高的樣本需要的分離時間更長。通常芯片旋轉(zhuǎn) 2 min 足以分離血細(xì)胞比容高達(dá) 60%的樣本，如圖 3 和圖 4。

圖 3 芯片旋轉(zhuǎn)開始分離血細(xì)胞、血漿定量及稀釋液定量Fig. 3 Blood cells separating, plasma and diluent metering

圖 4 完成分離血細(xì)胞(紅色)、血漿(黃色)定量及稀釋液定量Fig. 4 Blood cells (red) separating, plasma(yellow) and diluent metering completed

下一步是混合稀釋液和血漿。兩個毛細(xì)管大小的虹吸入口分別位于稀釋液定量槽的徑向最外側(cè)點處和樣本定量槽的旁路下方位置。在芯片第一次旋轉(zhuǎn)期間，這兩個虹吸管都沒有填充液體，因為向外的離心力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于向內(nèi)的毛細(xì)作用力。分離步驟結(jié)束后，試劑芯片停止旋轉(zhuǎn)，則虹吸微閥產(chǎn)生的毛細(xì)力會牽拉液體通過 U 形微流通道，兩個微流通道的出口通向芯片混合槽。

既然是求E點的坐標(biāo)，理所當(dāng)然想到過點E作ES⊥x軸，垂足為S，則問題轉(zhuǎn)化為求ES與AS的長，易知△ASE為等腰直角三角形，即ES=AS，所以問題轉(zhuǎn)化為求FS的值．由正方形的特征想到延長SE交CD于點R，易證△ESF≌△DRE且△REC也為等腰直角三角形，則FS=ER=CR=BS=1，所以點E的坐標(biāo)為(3，3)．依此類推，求M坐標(biāo)自然要過點M作MK⊥x軸，垂足為K，則需求FK與MK的值．由△ESF≌△DRE想到ED=EF，即△DEF為等腰直角三角形，所以∠DFM=

然后，芯片以 5000 rpm 的速度沿順時針方向旋轉(zhuǎn)，這時稀釋液定量槽會被完全清空。因為U 形微流通道的出口離芯片中心的距離比稀釋液定量槽離芯片中心的距離更遠(yuǎn)。樣本定量槽排空至血漿定量 U 形微流通道出口處的徑向距離位置。定量的血漿體積是 17.5 μL，其余的血漿和紅細(xì)胞被分隔于血漿定量槽的下半部分。

接下來，改變芯片的轉(zhuǎn)速以混勻混合槽中定量的稀釋液和血漿。芯片轉(zhuǎn)速急速降至 1000 rpm，再慢慢升至 4000 rpm，這種混合模式重復(fù) 12次。急減速提供了足夠的切向力來移動和混勻混合槽中的液體。在混合過程中所需的最低轉(zhuǎn)速為1000 rpm，目的是確保所施加的離心力超過最后一個 U 形微流通道的毛細(xì)作用力。這樣混合能夠防止 U 形微流通道發(fā)生虹吸，直到液體被均勻地混合為止，如圖 5。

圖 5 完成血漿(黃色)和稀釋液(藍(lán)色)混合(綠色)Fig. 5 The mix(green) of the plasma (yellow) and diluent (blue)

當(dāng)混合完全且芯片停止后，通過 U 形微流通道的毛細(xì)力引發(fā)虹吸作用。然后再以 3000 rpm的轉(zhuǎn)速沿順時針方向旋轉(zhuǎn)芯片 40 s。稀釋的血漿流出混合槽，并進(jìn)入分離通道，填充 21 個比色孔和隔離的廢液池。其中，21 個比色孔按順序填充，而剩余的稀釋血漿流入廢液池，如圖 6。

圖 6 完成稀釋后的血漿(綠色)進(jìn)樣Fig. 6 The diluted plasma(green) entering into the cuvettes

各比色孔都有一個單一通道，液流和空氣可經(jīng)該通道進(jìn)入和排放。通過電機(jī)對芯片的控制，液流從通道入口的一側(cè)向下流，空氣則從另一側(cè)排出。液流束的大小可通過虹吸的阻力、芯片的旋轉(zhuǎn)速度和其余流體前端的壓力來進(jìn)行控制。同時芯片必須旋轉(zhuǎn)得足夠快，以克服通道入口(寬0.50 mm 和高 0.14 mm)的毛細(xì)力。芯片的每個比色孔中含有一個或兩個適合于特定檢測項目的凍干試劑小球，這些小球在稀釋血漿填充比色孔時隨即完全溶解。

所有的比色孔充滿之后，過量的稀釋血漿被分隔于廢液池中，并使芯片從 1000 rpm 順時針方向旋轉(zhuǎn)變?yōu)?1000 rpm 逆時針方向旋轉(zhuǎn)，持續(xù)60 s。這種混合會在比色孔中形成漩渦模式，它能夠使試劑和稀釋液充分混合，并完成生物化學(xué)反應(yīng)，如圖 7。

分析儀的分光光度計通過與芯片旋轉(zhuǎn)同步閃爍的氙燈來監(jiān)測所有比色孔中的反應(yīng)，持續(xù)時間為 3.5 min。同時分析儀通過感測芯片比色孔間 45 度楔形件來對比色孔進(jìn)行定位。每次旋轉(zhuǎn)時，處理器會選擇對特定的比色孔進(jìn)行曝光，同時選擇特定的波長進(jìn)行測定。

圖 7 稀釋血漿和試劑混合并完成生化反應(yīng)Fig. 7 The mix of diluted plasma and reagents and biochemical reactions fulfilled

3 結(jié) 果

3.1 比色孔光程的重復(fù)性

3.2 液體定量和混合的精密度

由于光程和儀器所產(chǎn)生誤差是較小的，我們使用芯片在 Celercare M1 分析儀上通過測定英國朗道公司水平 3 質(zhì)控血清樣本(批號 496UE)血糖結(jié)果的精密度來粗略評估芯片對樣本和稀釋液定量以及兩者混合的精密度。使用質(zhì)控樣本在Celercare M1 分析儀上重復(fù)測定 20 次，血糖的平均值為 7.1 mmol/L，變異系數(shù)為 1.4%。

3.3 使用芯片測定生化項目的精密度

在測量過程中誤差的來源包括：血漿定量、稀釋液的定量、血漿和稀釋液混合的均勻程度，試劑和樣本空白比色孔的光程，試劑的不精密度，儀器與儀器間的差異，儀器噪聲以及在分析儀上測定質(zhì)控品的變化。我們依據(jù) CLSI EP5-A 文件[11]的要求進(jìn)行精密度試驗，選擇英國朗道公司水平 2 和水平 3 質(zhì)控血清(水平 2 批號729UN，水平 3 批號 496UE)作為實驗樣本，使用檢測芯片在 Celercare M1 分析儀上對此 2 個水平的樣本重復(fù)測定 20 次，計算均值()、標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(CV)，得到各生化項目批內(nèi)精密度相關(guān)數(shù)據(jù)。對此兩個濃度水平的樣本每天測定1 次，連續(xù)測定 20 天，計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，得到各生化項目日間精密度相關(guān)數(shù)據(jù)。我們對 15 項生化檢測項目的精密度進(jìn)行了測定，包括葡萄糖(GLU)、羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、膽固醇(CHOL)。各項目的批內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見表 1。

表 1 檢測芯片測定生化項目批內(nèi)和日間精密度結(jié)果Table 1 The results of within-run and day-to-day precision for biochemical items by microfluidic chip

4 討 論

微流控芯片技術(shù)具有消耗試劑少、所需樣本少、檢測時間短、成本低、操作簡便以及易于集成等優(yōu)點[3,4]。該芯片將樣本預(yù)處理和檢測過程集成于一體，全血、血清及血漿等樣本都可用于測定。分析時只需將 90 μL 樣本經(jīng)樣本孔注入含凍干試劑的芯片中，并經(jīng)稀釋液孔將 450 μL 稀釋液注入芯片中就可進(jìn)行定量分析。該芯片與便攜式 Celercare M1 分析儀配套使用，10 分鐘左右即能完成同一患者樣本的多項測試，最多可一次性獲得 14 項生化分析結(jié)果，操作簡便，檢測效率高，且可以在各種不同場合使用。然而該芯片仍然有需要進(jìn)一步改進(jìn)的地方，例如需要手工進(jìn)樣等。另外該芯片為一次性使用芯片，每次只能檢測一份樣本，因此該檢測芯片不適用于批量標(biāo)本的快速檢測。

使用芯片進(jìn)行測定時，芯片本身對測定結(jié)果不精密度的影響因素包括不同芯片之間比色孔光程的重復(fù)性，以及血漿和稀釋液定量的精密度和兩種液體混合均勻的一致程度。經(jīng)試驗芯片比色孔光程精密度的變異系數(shù)在0.08%～0.52%。血漿和稀釋液定量和混合的精密度變異系數(shù)小于 2%。

使用英國朗道公司水平 2 和水平 3 質(zhì)控血清樣本作為實驗樣本，用檢測芯片在 Celercare M1分析儀上測定各生化項目在兩個水平下的批內(nèi)和日間精密度。結(jié)果顯示，15 個生化項目批內(nèi)精密度的變異系數(shù)在 0.78%～3.45%，而日間精密度的變異系數(shù)在 0.97%～3.43%。這表明使用該芯片用于臨床生化項目的檢測時各項目的精密度符合臨床檢測的要求。

本文從芯片檢測原理、特點以及臨床應(yīng)用評估等方面介紹了 POCT 生化檢測芯片。該微流控生化芯片與傳統(tǒng)檢驗發(fā)揮各自優(yōu)勢，根據(jù)不同的需要，形成相輔相成的互補(bǔ)形式。隨著芯片實驗室以及家庭診療的日益發(fā)展，相信該微流控芯片未來在臨床檢測領(lǐng)域必有廣闊的應(yīng)用前景，并推動檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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A Centrifugal Microfluidic Chip for Biochemical Analysis

DAI Yonghui1CHEN Tan2WANG Zhanhui3

1(The Clinical Laboratory of Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine,Guangzhou510120,China)
2(Tianjin Mnchip Technologies Company Limited,Tianjin300457,China)
3(Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

In this paper, a low-cost, rapid, automated centrifugal microfluidic chip for biochemical analysis was presented. The chip integrates sample pre-processing and multi-biochemical items assay. Through multi-level microfluidic channels and micro-siphon valves, the chip combines the pre-treatment of samples, sample transportation and the reaction processes between sample and biochemical reagent. The results are obtained by colorimetric detection. It is shown that the reproducibility of cuvette pathlength for chip is from 0.08% to 0.52%. The coefficient of variation (CV) of sample, diluents metering and mixing for chip by the CV of blood glucose results is 1.4%. The CV of day-to-day and within-run precision for 15 biochemical items are less than 3.5%. Therefore, it is concluded that the centrifugal microfluidic chip for biochemical analysis can satisfy the clinical testing requirements.

microfluidic chip; biochemical analysis; point-of-care testing

R 331

A

2014-05-24

：2015-03-17

戴永輝，碩士，研究方向為 POCT 診斷技術(shù)及其臨床應(yīng)用；陳坦，碩士，研究方向為 POCT 微流控生化分析芯片；王戰(zhàn)會(通訊作者)，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為微流控檢測技術(shù)和 POCT 醫(yī)療器械，E-mail：zh.wang@siat.ac.cn。