蔣婷婷 ，盧端萍，王 勇，陳 碩，黃旭慧(.福建省立金山醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州35008;.福建省藥品檢驗所，福建 福州 35000)

靈芝是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，有“仙藥、瑞草”之稱，具有“久食輕身不老，延年神仙”之功效?！吨袊幍洹?2010 年版)收載靈芝品種，作為我國法定中藥材的是多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體［1-2］。研究結(jié)果證實，靈芝中含有多種的化學(xué)成分，其中靈芝多糖和靈芝三萜是靈芝主要的活性成分［3］。靈芝三萜具有抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗雄性激素、抗氧化、抗菌、抗補體、抗人類免疫缺陷病毒、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等功效［3-15］。目前，已經(jīng)從靈芝子實體，發(fā)酵菌絲體和靈芝孢子中分離出了130 多種的三萜化合物。赤芝醇提取物是指適時采收成熟的新鮮赤芝子實體，烘干后采用酒精提取、真空濃縮、噴霧干燥等工藝得到的靈芝浸膏粉，是靈芝粉高倍濃縮而成的靈芝精華，是眾多靈芝類保健品的主要原料，其質(zhì)量好壞直接影響到成品的質(zhì)量。目前，國內(nèi)外對靈芝的研究主要集中在靈芝子實體上，對靈芝提取物也只限于藥理活性的研究，尚未有關(guān)于靈芝醇提取物質(zhì)量控制的報道，本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對不同來源赤芝藥材經(jīng)過相同工藝制成的赤芝醇提取物中的三萜類進行特征圖譜研究，為赤芝醇提取物的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-2010A 型高效液相色譜儀(日本島津公司);TDL超聲波清洗器(昆山儀器有限公司)，超純水器(德國塞多利斯公司)。靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸A、靈芝酸H(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。赤芝醇提取物(福建仙芝樓生物科技有限公司采集不同產(chǎn)地赤芝子實體，經(jīng)過相同工藝制成)其來源及編號見S1:福建福州;S2:福建寧德;S3:福建福州;S4:吉林蛟河市;S5、S6:山東;S7:山東冠縣;S8:上海;S9:安徽霍山縣;S10:沈陽。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax-SB-C18(150 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%醋酸水溶液(B)(V∶V =25∶75)，梯度洗脫程序(0 ～32 min，25% ～26%A;32 ～50 min，26% ～27%A;50 ～60 min，27% ～26%A;60 ～61 min，26% ～30%A;61 ～70 min，30% ～32%A;70 ～80 min，32% ～35%A;80 ～90 min，35% A);檢測波長為256 nm;柱溫為25 ℃;流速為1.0 ml/min;進樣量為20 μl，記錄色譜圖見圖1 ～2。

圖1 對照品溶液色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substances

圖2 供試品溶液色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of test samples

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備:取靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸A、靈芝酸H對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 ml 含0.1 mg 芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸A、靈芝酸H 的溶液，即得。2.2.2 供試品溶液的制備:取靈芝醇提取物樣品約0.2 g，置25 ml 容量瓶中，加氯仿適量超聲處理10 min，放冷，加氯仿定容至刻度線，濾過。取續(xù)濾液5 ml 蒸干，用流動相定容至5 ml容量瓶即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗:取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次。以靈芝酸A 為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，其RSD＜1%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗:取同一赤芝醇提取物樣品(S10)6 份，按上述方法制備并進行檢測。以靈芝酸A 為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜1%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、18、24 h 進樣，按上述色譜條件測定，記錄各共有峰保留時間和峰面積。以靈芝酸A 為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜1%，表明靈芝醇提物的制備樣品在一日內(nèi)通過HPLC 分析結(jié)果穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 樣品的測定:稱取各赤芝醇提取物樣品，照“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按上述方法進行測定，以靈芝酸A(7 號峰)為參照峰，測得各赤芝醇提取物樣品的相對保留時間結(jié)果見表1，相對峰面積結(jié)果見表2。

2.4.2 樣品特征圖譜的相似度評價:將得到的各赤芝醇提取物的色譜圖數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入國家藥典委員會指紋圖譜評價系統(tǒng)，指定S10 為參照圖譜，自動匹配，即可生成對照特征圖譜R，并進行相似度評價。10 批赤芝醇提取物樣品與對照特征圖譜的相似度計算結(jié)果為0.86、0.922、0.915、0.910、918、0.986、0.968、0.947、0.983、0.972，見圖3。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本研究過程中選擇了4 個流動相系統(tǒng):(1)乙腈-水;(2)乙腈-0.1% 醋酸水溶液;(3)乙腈-0.5% 醋酸水溶液;(4)乙腈-2%醋酸水溶液。結(jié)果表明，各種流動相中以乙腈-0.1%醋酸水溶液系統(tǒng)為最佳，譜圖上各個色譜峰(256 nm)的分離度較好，因此選擇此流動相系統(tǒng)作為赤芝醇提物HPLC 特征圖譜檢測的流動相。

3.2 柱溫的選擇

本研究過程中選擇了25、30、35、40 ℃4 個溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫對各色譜峰的保留時間和分離度影響較大，其原因可能是流動相中加有乙酸，柱溫通過影響流動相中pH 值而影響色譜峰的保留時間。在上述流動相系統(tǒng)下，柱溫為25 ℃時各個色譜峰分離的較好，因此柱溫選擇25 ℃。

表1 赤芝醇提物樣品特征圖譜相對保留時間測定結(jié)果Tab 1 Test results of relative retention time in specific HPLC chromatogram of extraction of G． lucidum alcohol

表2 赤芝醇提物樣品特征圖譜相對峰面積測定結(jié)果Tab 2 Test results of relative retention peaks in specific HPLC chromatogram of extraction of G． lucidum alcohol

圖3 10 批赤芝醇提取物的特征圖Fig 3 Specific HPLC chromatogram of extractionof G． lucidum alcohol for ten batches of samples

3.3 提取溶劑的選擇

本研究過程中采用甲醇和氯仿作為提取溶劑，結(jié)果顯示，以氯仿作為提取溶劑其雜質(zhì)峰較甲醇的少，基線更平穩(wěn)。Wang Xiaoming 等［6］在研究中也比較了氯仿、甲醇、氯仿-甲醇3 種提取溶劑的效果，結(jié)果表明以氯仿作為提取溶劑能夠?qū)⑷苹衔锍浞值奶崛〕鰜恚胰苹衔锬軌虺浞值谋蝗芙庠诼确轮?。因此，選用氯仿作為赤芝醇提取物特征圖譜的提取溶劑。

3.4 結(jié)果分析

本研究建立的靈芝醇提取物特征圖譜，確定了11 個特征峰，選擇含量較高的靈芝酸A 為參照峰。結(jié)果顯示，不同樣品各共有峰的相對保留時間RSD＜1%，說明10 批樣品在化學(xué)成分上比較相似;而共有峰相對面積差異較大，由此可見，不同產(chǎn)地以及同一產(chǎn)地不同批次的赤芝醇提取物的含量有著一定的差異。赤芝醇提取物的對照指紋圖譜相似度評價結(jié)果顯示:S2 ～S10 樣品各色譜之間的相似度在0.91 ～0.986 之間，均在0.900 之上，S1 樣品的相似度為0.86，說明靈芝醇提取物樣品組間存在一定的差異，可能系不同的種植環(huán)境、不同的培養(yǎng)基質(zhì)及不同的采收時間等因素所致。

綜上所述，本研究首次對靈芝醇提取物的特征圖譜進行研究，建立的特征圖譜能夠考察靈芝醇提取物樣品之間質(zhì)量的穩(wěn)定性及鑒別其真?zhèn)?，為靈芝醇提取物質(zhì)量控制提供了深層次評價質(zhì)量的參考依據(jù)。

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