游 燕 ，潘 智，譚 方，黃丁英，易春霞，劉圓圓(桂林市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣西 桂林 541002)

舒乳凝膠是根據(jù)桂林市中醫(yī)醫(yī)院乳腺科協(xié)定處方舒乳散開發(fā)的新型外用劑型，功能軟堅(jiān)散結(jié)、活血止痛、清熱解毒，用于治療氣滯血瘀、痰凝互結(jié)的乳癖［1-4］。處方由肉桂、丁香、生天南星、生半夏、山柰、威靈仙、芥子、豬牙皂、白胡椒、樟腦組成，因處方中含有毒性藥材生天南星和生半夏，為了保證臨床用藥安全，故對(duì)舒乳凝膠進(jìn)行毒理學(xué)研究，開展急性毒性、皮膚刺激性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)［5-6］，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品

成年健康白色家兔，體質(zhì)量為2 ～2.5 kg，雌雄各半，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。受試動(dòng)物皮膚光滑、無損傷、無皮膚病。受試藥品為舒乳凝膠(批準(zhǔn)文號(hào):20140610)。凝膠中藥物濃度為0.25 g 生藥/g(臨床應(yīng)用劑量，低劑量)和0.50 g生藥/g(高劑量)。

1.2 儀器

JH2102 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，ABX Pentra DF120 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(法國(guó)ABX)，美國(guó)雅培Aeroset 全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)雅培)。

1.3 方法

給藥前24 h，將家兔的背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%。去毛后24 h 檢查去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不宜作完好皮膚的毒性試驗(yàn)。破損皮膚的制作采用不同方法將去毛消毒皮膚劃破，以滲血為度［7-9］。

1.3.1 急性毒性試驗(yàn):將家兔分成5 組，一組空白對(duì)照組，應(yīng)用空白凝膠;4 組試驗(yàn)組，分別為完整皮膚和破損皮膚組，每組4 只，應(yīng)用高劑量和低劑量舒乳凝膠。低劑量組家兔應(yīng)用舒乳凝膠(0.25 g 生藥/g)，高劑量組家兔應(yīng)用的藥物濃度為低劑量組的2 倍(0.50 g 生藥/g)，均勻涂于脫毛區(qū)，1 次2 g，1 日3 次，涂抹2 min 至其吸收完全，每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。給家兔受試物24 h 后，用溫水除去殘留的受試物后，正常飼養(yǎng)14 d，每日觀察并記錄家兔的體質(zhì)量、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等指標(biāo)的變化及其他中毒表現(xiàn)，若出現(xiàn)死亡動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)尸檢，當(dāng)有肉眼可見病變時(shí)，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.3.2 皮膚刺激性試驗(yàn):(1)單次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn):家兔分成4 個(gè)試驗(yàn)組，完整皮膚和破損皮膚組，每組4 只，各高劑量和低劑量舒乳凝膠低劑量組家兔應(yīng)用舒乳凝膠(0.25 g生藥/g)，高劑量組家兔應(yīng)用的藥物濃度為低劑量組的2 倍(0.50 g 生藥/g)，給藥區(qū)涂抹受試藥2 g，對(duì)照區(qū)涂抹空白凝膠2 g，涂抹2 min 至其吸收完全。涂抹24 h 后用溫水洗去涂抹的殘留物，分別在除去藥物后1、24、48、72 h 觀察和記錄用藥部位皮膚反應(yīng)。(2)多次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn):分成4 個(gè)試驗(yàn)組，完整皮膚和破損皮膚組，每組4 只，應(yīng)用高劑量和低劑量舒乳凝膠。每日按單次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)方法給藥，連續(xù)7 d，去除藥物后1 h 觀察和記錄皮膚是否有紅斑、水腫、涂藥部位是否有出血點(diǎn)、變薄或變粗糙等異常情況，對(duì)皮膚紅斑及水腫按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。最后一次貼敷，除去藥物后1、24、48、72 h 觀察和記錄用藥部位皮膚反應(yīng)。

1.3.3 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn):將家兔分為5 組，對(duì)照組家兔應(yīng)用空白凝膠;4 組試驗(yàn)組家兔分為完整皮膚和破損皮膚組，每組6 只，各應(yīng)用高劑量和低劑量舒乳凝膠。低劑量組家兔應(yīng)用舒乳凝膠(0.25 g 生藥/g)，高劑量組家兔應(yīng)用的藥物濃度為低劑量組的2 倍(0.50 g 生藥/g)，均勻涂于脫毛區(qū)，1 次2 g，1 日3 次。給藥區(qū)涂抹受試藥2 g，對(duì)照區(qū)涂抹空白凝膠2 g，涂抹2 min 至其吸收完全。6 h 后用溫水洗去殘留物，連續(xù)應(yīng)用4 周。每日觀察記錄家兔的一般情況，停藥后每組隨機(jī)抽取2/3 家兔心臟采血，用細(xì)胞分析儀做血液指標(biāo)測(cè)定;分離血漿，用生化分析儀測(cè)定天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等生化指標(biāo);隨后處死動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，對(duì)上述臟器和給藥部位皮膚置10%甲醛中固定，常規(guī)制作石蠟切片，HE 染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查。剩余動(dòng)物停藥飼養(yǎng)觀察14 d 后作同樣檢查，以便確定受試物毒性反應(yīng)的恢復(fù)程度［10-12］。

1.4 觀察指標(biāo)與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

觀察各組家兔的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果、皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果及長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果觀察指標(biāo)主要包括體質(zhì)量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞百分比(LY%)、ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血糖(GLU)及心、肝、脾、肺、腎各臟器系數(shù)等指標(biāo)。參照相關(guān)文獻(xiàn)皮膚刺激性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每只家兔皮膚刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分［13］，見表1。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):刺激指數(shù):(紅斑反應(yīng)總分+水腫反應(yīng)總分)/每組動(dòng)物數(shù)。刺激分值為:0 ～0.5 分無刺激;0.5 ～3.0 分為輕度刺激;3.0 ～6.0 分為中度刺激;6.0 ～8.0 分為強(qiáng)度刺激。

表1 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Scoring standards of reactions of skin irritation

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示、采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒乳凝膠急性毒性試驗(yàn)對(duì)5 組家兔體質(zhì)量影響的比較

用藥14 d 后，空白對(duì)照組和給藥組家兔體質(zhì)量正常增加，各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。研究結(jié)果表明，舒乳凝膠藥物濃度為0.25 g 生藥/g 和0.50 g 生藥/g 外用在完整或破損家兔皮膚上，均未引起急性毒性反應(yīng)。

表2 舒乳凝膠急性毒性試驗(yàn)對(duì)5 組家兔體質(zhì)量影響的比較(xˉ±s)Tab 2 Effects of acute toxicity test of shuru gel on the body mass of rabbits(xˉ±s )

2.2 舒乳凝膠多次給藥對(duì)家兔皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果比較

舒乳凝膠低、高劑量組家兔單次給藥后，完整皮膚和破損皮膚均未形成局部紅斑和水腫，未見刺激性，與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。多次給藥結(jié)果表明，舒乳凝膠連續(xù)給藥7 d，完整皮膚和破損皮膚均未形成局部紅斑和水腫，均未見刺激性，與空白對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。研究結(jié)果表明，舒乳凝膠藥物濃度為0.25 g 生藥/g 和0.50 g生藥/g 外用對(duì)家兔的完整或破損皮膚均無刺激作用。

表3 舒乳凝膠多次給藥對(duì)家兔皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果比較Tab 3 The skin irritation test results of shuru gel with many times of administration

2.3 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果

給藥期間，各劑量組動(dòng)物外觀正常，活潑，皮毛光澤，眼、鼻、耳、口、生殖器無異常分泌物，大小便顏色形狀均正常，各給藥組動(dòng)物也未有毒性癥狀出現(xiàn)，給藥期間無動(dòng)物死亡。

2.3.1 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔不同時(shí)間段體質(zhì)量的比較:各組家兔體質(zhì)量均逐周增長(zhǎng)，給藥期間各試驗(yàn)組家兔體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

2.3.2 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔血液學(xué)指標(biāo)的比較:用藥28 d 后，各試驗(yàn)組家兔RBC、HGB、PLT、WBC、LY%各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表5。

2.3.3 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔生化學(xué)指標(biāo)的比較:用藥28 d 后，各試驗(yàn)組家兔血液AST、ALT、ALP、TP、ALB、GLU與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表6。

表4 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔不同時(shí)間段體質(zhì)量的比較(kg，±s)Tab 4 Effects of acute toxicity test of shuru gel on the body mass of rabbits in different periods(kg，±s)

表4 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔不同時(shí)間段體質(zhì)量的比較(kg，±s)Tab 4 Effects of acute toxicity test of shuru gel on the body mass of rabbits in different periods(kg，±s)

組別 給藥前 給藥后7 d 14 d 21 d 28 d空白對(duì)照組(n=6) 2.19±0.26 2.48±0.26 2.61±0.23 2.64±0.24 2.74±0.17低劑量完整皮膚組(n=6) 2.22±0.25 2.52±0.22 2.63±0.25 2.60±0.24 2.79±0.21高劑量完整皮膚組(n=6) 2.22±0.22 2.54±0.23 2.72±0.22 2.78±0.24 2.94±0.23低劑量破損皮膚組(n=6) 2.16±0.20 2.24±0.25 2.51±0.20 2.55±0.21 2.70±0.18高劑量破損皮膚組(n=6) 2.21±0.22 2.43±0.25 2.58±0.26 2.64±0.26 2.6 7±0.32

2.3.4 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔臟器系數(shù)的比較:用藥28 d 后，各試驗(yàn)組家兔臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表7。

表5 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔血液學(xué)指標(biāo)的比較(±s)Tab 5 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on haematological indexes of rabbits(±s)

表5 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔血液學(xué)指標(biāo)的比較(±s)Tab 5 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on haematological indexes of rabbits(±s)

組別 RBC/(×1012/L) HGB/(g/L) PLT/(×109/L) WBC/(×109/L)LY/%空白對(duì)照組(n=6) 6.18±0.68 122.50±9.01 433.83±84.58 11.20±6.27 60.88±17.33低劑量完整組(n=6) 6.42±0.50 127.50±4.64 478.83±113.36 12.78±3.28 55.67±19.66高劑量完整組(n=6) 6.24±0.34 125.80±6.72 445.20±121.96 10.48±4.84 57.34±14.43低劑量破損組(n=6) 6.56±0.38 127.67±3.44 431.33±100.41 9.85±3.01 51.47±13.90高劑量破損組(n=6) 6.11±0.63 120.33±12.18 402.00±91.35 9.93±3.79 51.92±21.83

表6 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔生化學(xué)指標(biāo)的比較(±s)Tab 6 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on blood biochemical indexes of rabbits(±s)

表6 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔生化學(xué)指標(biāo)的比較(±s)Tab 6 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on blood biochemical indexes of rabbits(±s)

組別 AST/(U/L) ALT/(U/L) ALP/(U/L) TP/(g/L) ALB/(g/L) GLU/(mmol/L)空白對(duì)照組(n=6) 35.8±11.16 60.17±23.87 77.17±30.45 65.92±3.90 41.68±2.46 6.42±0.84低劑量完整組(n=6) 27.33±6.86 53.67±11.60 89.50±25.63 69.08±6.98 41.35±1.57 6.04±0.51高劑量完整組(n=6) 39.3±20.54 74.50±36.19 68.33±12.03 65.13±4.95 41.50±1.52 6.79±0.44低劑量破損組(n=6) 38.5±14.67 77.83±25.12 96.83±12.75 67.02±7.97 39.98±1.43 5.98±0.54高劑量破損組(n=6) 63.5±45.93 68.00±12.93 72.83±22.24 64.1±10.72 39.40±4.21 6.11±0.41

表7 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔臟器系數(shù)的比較(g/kg，±s)Tab 7 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on coefficient of organs of rabbits(g/kg，±s)

表7 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔臟器系數(shù)的比較(g/kg，±s)Tab 7 Effects of acute long-term toxicity test of shuru gel on coefficient of organs of rabbits(g/kg，±s)

組別 心 肝 脾 肺 腎空白對(duì)照組(n=6) 2.76±0.30 28.04±4.35 0.44±0.05 4.92±0.73 4.97±0.35低劑量完整組(n=6) 2.24±0.15 30.24±2.11 0.45±0.07 3.79±0.40 4.68±0.29高劑量完整組(n=6) 2.43±0.50 26.41±4.47 0.49±0.10 3.94±0.51 5.10±0.12低劑量破損組(n=6) 2.41±0.20 29.71±3.55 0.52±0.15 4.32±0.41 5.14±0.49高劑量破損組(n=6) 2.35±0.18 31.68±1.81 0.46±0.05 4.11±0.30 5.24±0.39

2.3.5 舒乳凝膠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中各組家兔臟器組織形態(tài)學(xué)變化的比較:用藥28 d 后，對(duì)各組家兔進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其心、肝、脾、肺、腎等臟器組織均未見病理改變，各組均未見水腫、表皮增生、角化等現(xiàn)象;對(duì)照組未見慢性炎細(xì)胞，各試驗(yàn)組家兔臟器組織形態(tài)學(xué)變化情況與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

舒乳凝膠處方含有毒性成分生天南星、生半夏，其毒性成分是毒針晶，毒針晶中的凝集素蛋白均具有顯著促炎作用，毒針晶的刺激性毒性是凝集素蛋白隨毒針晶刺入組織后誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥刺激性毒性［14］。藥材的水及各有機(jī)溶劑提取物經(jīng)鏡檢均無針晶，對(duì)皮膚黏膜沒有刺激性［15］。本研究中，長(zhǎng)期應(yīng)用以提取液制成的舒乳凝膠長(zhǎng)對(duì)家兔皮膚黏膜無明顯刺激，對(duì)血液系統(tǒng)和主要臟器無顯著不良影響，為比較安全的外用藥物。

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