田英杰， 孫 進(jìn)，2， 謝振興， 馬玉華， 樂國偉，2， 施用暉*，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

γ-氨基丁酸改善高脂膳食小鼠的骨性能

田英杰1， 孫 進(jìn)1，2， 謝振興1， 馬玉華1， 樂國偉1，2， 施用暉*1，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

探討了高脂膳食小鼠補(bǔ)充γ-氨基丁酸（GABA）對骨性能的影響。40只6周齡C57BL/6雄性小鼠，隨機(jī)分成4組：正常日糧組（control），高脂日糧組（HFD），高脂日糧小鼠飲水補(bǔ)充0.06、0.12 g/dL GABA組。試驗(yàn)結(jié)束前一周收集各組小鼠尿液，測定鈣及羥脯氨酸含量；第20周結(jié)束試驗(yàn)，測定小鼠股骨、脛骨參數(shù)，以及股骨氧化還原指標(biāo)，熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，HFD組股骨出現(xiàn)氧化應(yīng)激，股骨GAD65顯著下調(diào)、GABAbR顯著上調(diào)（P＜0.05），GSK3β顯著上調(diào)而Nrf2顯著下調(diào)（P＜0.05）；股骨和脛骨鈣含量、骨強(qiáng)度等相關(guān)性能指標(biāo)顯著降低，尿鈣及羥脯氨酸含量顯著增高，且成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因BGLAP2、col1a1顯著下調(diào)，破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因RANKL/OPG、CTSK、TRAP顯著上調(diào) （P＜0.05）。補(bǔ)充0.06、0.12 g/dL GABA可恢復(fù)GABAbR、GSK3β、Nrf2表達(dá)（P＜0.05），減輕股骨氧化損傷，同時平衡骨細(xì)胞分化及代謝，提高股骨和脛骨性能。結(jié)果表明，GABA可調(diào)節(jié)股骨氧化還原狀態(tài)，平衡骨代謝，改善股骨及脛骨性能；0.12 g/dL GABA改善股骨氧化應(yīng)激和股骨性能的作用優(yōu)于0.06 g/dL的。

γ-氨基丁酸；骨性能；高脂日糧；氧化應(yīng)激；小鼠

長期高脂膳食飼喂小鼠，伴隨著肥胖發(fā)生，小鼠股骨出現(xiàn)氧化應(yīng)激并誘發(fā)骨代謝失衡，股骨礦物質(zhì)含量及骨強(qiáng)度顯著下降[1-2]。γ-氨基丁酸 （γaminobutyric acid，GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，給高脂膳食小鼠補(bǔ)充GABA可抑制肥胖的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)節(jié)異常血糖[3]，減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激[4]；且用一定劑量GABA飼喂去卵巢大鼠可顯著提高成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)[5]。但GABA是否對高脂膳食下氧化應(yīng)激介導(dǎo)的異常骨代謝及骨性能具有調(diào)節(jié)作用尚不清楚。GSK3β是抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)[6-7]，而GABA-B型受體（GABAbR）參與抑制GSK3β活性[8]，可能間接利于Nrf2入核發(fā)揮抗氧化作用。體外試驗(yàn)證實(shí)，成骨細(xì)胞可表達(dá)GABAbR[9]，然而GABA是否在骨組織中通過該受體激活Nrf2抗氧化系統(tǒng)尚未見研究報道。本課題旨在研究GABA能否通過減輕氧化應(yīng)激改善骨代謝、提高骨性能，并探討GABA發(fā)揮抗氧化作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

GABA，純度99%，sigma公司產(chǎn)品；Trizol裂解液，美國Biomiga公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNAse Inhibitor，dNTPs，TaqDNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；DEPC，Generay Biotech公司產(chǎn)品；熒光染料SBY，Bioneer公司產(chǎn)品；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司合成；還原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙二醛（MDA），總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，購自南京建成生物公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動物及樣本制備

40只6周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠，合格證號SCXK（滬）2007-0005，上海斯萊克動物有限責(zé)任公司提供，初始體質(zhì)量18～20 g。正常日糧預(yù)飼1周后隨機(jī)分為4組：正常日糧組（control）；高脂日糧組（HFD），給予純水飲用；高脂日糧小鼠飲水補(bǔ)充0.06、0.12 g/dL GABA組，同文獻(xiàn)[4]。正常飼料和高脂飼料配方見表1。小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，室內(nèi)溫度（23±2）℃、濕度60%，給予12 h/12 h白天-夜晚循環(huán)光照。

試驗(yàn)第19周，連續(xù)3天收集小鼠尿液，用于測定鈣和羥脯氨酸含量；于試驗(yàn)第20周，將各組小鼠禁食12 h，乙醚麻醉后處死小鼠，迅速取小鼠股骨、脛骨去除附著組織，取左腿股骨頭置于Trizol中用于總RNA提取，剩余部分勻漿后擬測定氧化還原指標(biāo)；同時取右腿股骨、脛骨保存于-80℃，用于股骨、脛骨性能指標(biāo)測定。所有試驗(yàn)操作均按照江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會的指導(dǎo)規(guī)則進(jìn)行。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 股骨、脛骨性能參數(shù)測定骨長度（femoral length，cm）：用游標(biāo)卡尺測定股骨、脛骨長度；骨強(qiáng)度（femoral strength，N）：將股骨、脛骨分別置于質(zhì)構(gòu)儀上（Stable Micro System，英國），固定兩端股骨頭，加載速度2 mm/s，股骨斷裂以后，計(jì)算機(jī)界面上顯示載荷變形曲線，獲得最大載荷值；股骨、脛骨干質(zhì)量（g）：105℃烘干至恒質(zhì)量；灰分（BMC，mg）：將樣品置于馬弗爐 （SX-4-10型箱式電阻爐控制箱，天津市泰斯特儀器有限公司制）500℃灰化至恒質(zhì)量，測定灰分質(zhì)量；鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（femoral Ca content，mg/ g）：灰分加入濃鹽酸，煮沸10 min，定容至10 mL，采用EDTA滴定法測定鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以mg/g計(jì)量；計(jì)算骨骼指數(shù)：骨骼指數(shù)（mg/mm）=骨干質(zhì)量/骨長度，能夠反映骨密度。

表1 飼料配方Table 1 Composition of diets

1.3.2 尿液鈣及羥脯氨酸含量測定尿液中鈣、羥脯 氨 酸 （hydroxyproline，HOP） 含 量 和 肌 酐（creatinine，Cr）含量檢測，嚴(yán)格按照南京建成試劑盒說明書操作。

1.3.3 股骨氧化還原狀態(tài)測定MDA（nmol/mg）采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活力 （U/mg）采用黃嘌呤氧化酶法測定，T-AOC（U/mg）采用菲啉類絡(luò)合物比色法測定，以上測定均嚴(yán)格按照南京建成試劑盒說明書操作；組織蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)法測定，GSH和GSSG含量采用熒光比色法（SpectraMax M5/M5e酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司制）測定。

1.3.4 實(shí)時熒光相對定量PCR分析提取股骨頭的總RNA，測定260 nm/280 nm吸光度比值1.8～2.0（one-drop spectrophotometer，上海采邑生物科技有限公司提供），逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以β-actin為內(nèi)參，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（7900HT Fast Realtime PCR儀，美國應(yīng)用系統(tǒng)公司制），檢測模板Ct值進(jìn)行相對定量，引物序列見表2。股骨頭總RNA提取方法參照文獻(xiàn)[10]并根據(jù)試驗(yàn)條件改進(jìn)。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers in quantitative real-time PCR

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理后采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為P<0.05。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析兩變量之間的相關(guān)性，得到相關(guān)系數(shù)及顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GABA對高脂膳食小鼠股骨、脛骨性能的影響

由表3可知，飲食干預(yù)20周，HFD組體質(zhì)量顯著高于對照組，而0.06、0.12 g/dL GABA組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比，HFD組股骨長度、干質(zhì)量、灰分、鈣含量、骨骼指數(shù)以及骨強(qiáng)度均顯著下降（P＜0.05）；脛骨長度、灰分、鈣含量、骨強(qiáng)度均顯著低于正常膳食小鼠，提示HFD組伴隨著肥胖發(fā)生，股骨及脛骨性能下降。相對HFD組，0.06 g/dL GABA組股骨長度顯著增長 （P＜0.05），干質(zhì)量、灰分、鈣含量、骨骼指數(shù)、骨強(qiáng)度分別增加4.60%、12.84%、4.29%、5.92%、9.71%（P＞0.05），同時脛骨長度、鈣含量、骨強(qiáng)度顯著提高（P＜0.05），灰分增加10.20%（P＞0.05）；而0.12 g/dL GABA組股骨干質(zhì)量、灰分、骨骼指數(shù)分別提高4.82%、12.17%、8.71%（P＞0.05），股骨長度、鈣含量、骨強(qiáng)度顯著提高（P＜0.05），同時脛骨鈣含量顯著增加、骨強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），脛骨灰分增加10.29%（P＞0.05），表明飲水補(bǔ)充GABA在抑制高脂膳食小鼠肥胖發(fā)生的過程中，可提高股骨及脛骨性能。其中，0.12 g/dL GABA組對體質(zhì)量和股骨性能干預(yù)作用優(yōu)于0.06 g/dL組的。

表3 各組小鼠股骨、脛骨參數(shù)（±s）Table 3 Femur and tibia parameters of mice in different groups（±s）

表3 各組小鼠股骨、脛骨參數(shù)（±s）Table 3 Femur and tibia parameters of mice in different groups（±s）

注：表內(nèi)數(shù)值上標(biāo)相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同字母表示差異顯著（P＜0.05），下表同。

測定項(xiàng)目 對照組HFD組HFD+GABA組0.06 g/dL體質(zhì)量/g 0.12 g/dL27.03±0.92a33.23±3.63c30.52±1.81b28.97±1.74b股骨股骨長度/mm15.85±0.30a16.44±0.17b干質(zhì)量/mg52.88±1.14b48.87±5.19ab股骨鈣/(mg/g)140.42±9.09b127.79±4.83a48.97±4.73ab133.27±8.39ab139.19±8.21b16.32±0.34b29.91±2.93aBMC/mg34.68±0.91b46.72±3.95a33.55±3.64ab股骨指數(shù)/（mg/mm）2.87±0.22a3.20±0.06b33.75±4.05ab3.12±0.26ab3.04±0.26ab股骨強(qiáng)度/N21.02±1.15b17.72±1.15a16.19±0.25b19.44±1.54ab20.55±1.42b脛骨股骨長度/mm17.93±0.11a18.25±0.30c18.09±0.14bc18.00±0.09ab干質(zhì)量/mg39.82±2.22 39.07±3.54125.88±17.56a36.38±2.51153.54±13.01b151.65±23.11b146.22±19.29b股骨鈣/(mg/g)26.12±0.99bBMC/mg 23.14±1.85a25.50±2.76ab25.52±2.75ab股骨指數(shù)/（mg/mm）2.20±0.092.07±0.152.17±0.19股骨強(qiáng)度/N 2.11±0.2014.44±0.77b38.12±3.8312.90±0.94a14.62±1.08b14.46±1.12b

2.2 GABA對高脂膳食小鼠尿液鈣、羥脯氨酸含量的影響

骨轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的生物代謝標(biāo)志物能夠用來預(yù)測骨量丟失的速率并評估骨折風(fēng)險[11]，其中羥脯氨酸是膠原蛋白質(zhì)特有降解產(chǎn)物，尿液中鈣含量也與絕經(jīng)后婦女的骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)[12]。圖1表明，HFD小鼠尿液中羥脯氨酸和鈣含量顯著高于正常膳食小鼠，反映肥胖小鼠體內(nèi)較強(qiáng)的骨分解活動。相較于HFD組，0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組的尿鈣、羥脯氨酸含量降低至與對照組無顯著差異（P＞0.05），反映出一定劑量GABA可抑制高脂膳食下異?；钴S的骨基質(zhì)分解活動。

圖1 各組小鼠尿液中羥脯氨酸和鈣含量Fig.1 Urinary HOP and calcium content in different groups

2.3 GABA對高脂膳食小鼠骨細(xì)胞分化的影響

圖2表明，HFD組股骨RANKL/OPG、CTSK、TRAP比對照組顯著上調(diào)（P＜0.05），Col1a1、BGLAP2表達(dá)顯著下降（P＜0.05），反映出HFD小鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞分化受抑制、破骨細(xì)胞分化作用增強(qiáng)。飲水補(bǔ)充 0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組 RANKL/OPG、CTSK、TRAP顯著下調(diào)（P＜0.05），Col1a1、BGLAP2表達(dá)上升且與對照組無顯著差異。由此推斷，GABA可通過在分子水平調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，維持骨代謝平衡。

圖2 成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)Fig.2 Osteoblast-and osteoclast-specific genes expression

2.4 GABA對高脂膳食小鼠股骨氧化還原狀態(tài)的影響

如表4所示，HFD組相較于對照組GSH/GSSG比值顯著下降，T-AOC、SOD顯著降低，MDA含量上升（P＜0.05）。相對HFD組，0.06 g/dL GABA組股骨MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH/GSSG比值上升（P＞0.05）；0.12 g/dL GABA組GSH/GSSG比值顯著上升，T-AOC顯著提高，同時氧化損傷MDA含量顯著降低（P＜0.05）。表明外源性GABA進(jìn)入體內(nèi)，能夠改善股骨氧化還原狀態(tài)，且0.12 g/dL作用優(yōu)于0.06 g/dL的。

表4 各組小鼠股骨氧化還原狀態(tài)（±s）Table 4 Femoral oxidative redox status of mice in different groups（±s）

表4 各組小鼠股骨氧化還原狀態(tài)（±s）Table 4 Femoral oxidative redox status of mice in different groups（±s）

項(xiàng)目0.41±0.02b對照組0.06 g/dL0.36±0.04aHFD+GABA組0.38±0.02ab0.40±0.03bHFD組0.12 g/dLGSH/GSSGT-AOC2.12±0.12bSOD 10.58±0.90bMDA 1.48±0.95a1.56±0.20a8.54±0.71a8.87±1.42ab8.41±1.72a2.01±0.17a2.53±0.45b2.09±0.24b1.81±0.30a1.78±0.29a

2.5 GABA對高脂膳食小鼠GABA信號分子和GSK3β/Nrf2表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，HFD組GAD67下調(diào)（P＞0.05），GAD65顯著下調(diào)（P＜0.05），GABAbR1異常上調(diào)（P＜0.05），推測高脂膳食小鼠對GABA存在需求；同時，HFD組小鼠股骨GSK3β表達(dá)比正常小鼠顯著上調(diào)，Nrf2表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.05），表明HFD組Nrf2抗氧化系統(tǒng)抵抗氧化應(yīng)激能力下降。而相對HFD組，補(bǔ)充0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組GABAbR表達(dá)顯著恢復(fù)至正常水平 （P＜0.05），GAD65不同程度提高，同時股骨GSK3β和Nrf2表達(dá)恢復(fù)正常水平。

圖3 GAD、GABAbR1和GSK3β、Nrf2表達(dá)Fig.3 Expression of GAD，GABAbR1 and GSK3β，Nrf2

2.6 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析可知，股骨MDA與股骨鈣含量（r=-0.422）、骨骼指數(shù) （r=-0.526）、骨強(qiáng)度 （r=-0.406）顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與股骨長度（r=-0.503）極顯著負(fù)相關(guān) （P＜0.01）；T-AOC與股骨長度 （r= 0.494）、骨骼指數(shù)（r=0.460）、灰分（r=0.553）、骨強(qiáng)度（r=0.471）顯著正相關(guān)（P＜0.05）；GSH/GSSG與股骨長度（r=0.807）、鈣含量（r=0.562）極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明氧化應(yīng)激是股骨性能下降的重要原因。同時，GAD65與Nrf2極顯著正相關(guān) （r=0.624，P＜0.01），GABAbR1與GSK3β（r=0.585）極顯著正相關(guān)，與Nrf2（r=-0.568）極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明GABA信號異常可能是Nrf2表達(dá)下調(diào)的重要原因。

3 討論

已有研究證實(shí)，高脂膳食下氧化應(yīng)激會導(dǎo)致動物體內(nèi)骨代謝失衡、股骨性能下降[1-2]。本研究結(jié)果表明，飲食干預(yù)第20周，HFD組股骨出現(xiàn)嚴(yán)重氧化應(yīng)激，尿鈣及羥脯氨酸含量顯著高于對照組且股骨及脛骨性能下降，這與前人研究結(jié)果基本一致。體外試驗(yàn)證實(shí)，GABA能夠捕獲脂肪氧化過程中的中間產(chǎn)物，并直接與MDA反應(yīng)生成熒光或非熒光產(chǎn)物，從而減少M(fèi)DA生成量[13]；體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，外源GABA可提高機(jī)體抗氧化酶活，減輕氧化損傷[4]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充0.06、0.12 g/dL GABA能夠不同程度改善股骨氧化還原狀態(tài)，同時顯著降低尿鈣和羥脯氨酸含量，使股骨及脛骨相關(guān)性能參數(shù)恢復(fù)至正常水平；其中，補(bǔ)充0.12 g/dL GABA作用優(yōu)于補(bǔ)充0.06 g/dL的。相關(guān)性分析表明，抗氧化物質(zhì)GSH/GSSG、T-AOC與股骨相關(guān)性能指標(biāo)存在顯著或極顯著正相關(guān)，MDA與股骨相關(guān)性能指標(biāo)顯著負(fù)相關(guān)。由此推斷，GABA可能通過減輕高脂膳食小鼠股骨氧化應(yīng)激，平衡骨代謝，提高股骨和脛骨性能。本研究進(jìn)一步從分子水平證實(shí)，HFD組骨細(xì)胞分化失衡，而補(bǔ)充GABA可平衡骨細(xì)胞分化，即提高成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因col1a1、BGLAP2表達(dá)，降低RANKL/OPG比值及破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因TRAP、CTSK表達(dá)，這在一定程度上解釋了GABA平衡骨代謝、提高骨性能的分子機(jī)制。

GABA具有減輕股骨氧化應(yīng)激的作用，可能與成骨細(xì)胞表達(dá)的GABAbR有關(guān)。Nrf2是骨組織中抵抗氧化應(yīng)激的重要核轉(zhuǎn)錄因子[14]，通過進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，啟動II相抗氧化酶表達(dá)[15]。長期氧化應(yīng)激會激活GSK3β，進(jìn)而磷酸化相關(guān)激酶導(dǎo)致Nrf2出核降解[7]。而相關(guān)研究證實(shí)，GABAbR介導(dǎo)的生理功能可促進(jìn)GSK3β磷酸化失活[8]，這可能間接有利于Nrf2入核。本試驗(yàn)中，HFD組股骨GAD65比對照組顯著下調(diào)，GABAbR表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），推測GABA可能合成不足，骨組織微環(huán)境中GABA濃度過低；給高脂膳食小鼠補(bǔ)充一定劑量GABA后，相對HFD組，GABAbR表達(dá)恢復(fù)至正常水平，可能外源性GABA進(jìn)入機(jī)體補(bǔ)充其生理濃度，滿足了股骨需求。有研究指出，高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞游離ATP水平增加，抑制GAD65表達(dá)，釋放的GABA水平降低[16]。高脂膳食小鼠股骨GAD65表達(dá)水平下降可能與機(jī)體異常糖脂代謝相關(guān)，作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。伴隨著高脂膳食小鼠股骨GABAbR顯著上調(diào)，GSK3β表達(dá)未被抑制，可能該受體高表達(dá)是機(jī)體代償性表現(xiàn)，并非GABA信號活躍；而補(bǔ)充GABA后伴隨著股骨GABAbR表達(dá)恢復(fù)正常，GSK3β下調(diào)，Nrf2表達(dá)上調(diào)，可能此時GABAbR介導(dǎo)外源GABA對GSK3β的正常抑制作用，間接提高Nrf2表達(dá)。相關(guān)性分析表明，GABA信號分子GAD65、GABAbR和GSK3β、Nrf2存在相關(guān)，表明干預(yù)異常GABA信號分子表達(dá)可能有利于Nrf2表達(dá)恢復(fù)。

4 結(jié)語

研究表明，GABA可改善股骨氧化還原狀態(tài)，從分子水平干預(yù)骨細(xì)胞分化，平衡骨代謝，提高股骨及脛骨性能；0.12 g/dL GABA改善股骨氧化應(yīng)激和股骨性能的作用優(yōu)于 0.06 g/dL；GABA可恢復(fù)GABAbR表達(dá)，抑制GSK3β和提高Nrf2 mRNA表達(dá)水平，而其對Nrf2的促進(jìn)作用是否通過GABAbR抑制GSK3β實(shí)現(xiàn)，有待進(jìn)一步證實(shí)?？傊?，GABA在干預(yù)骨質(zhì)疏松方面具有潛在的生理功能和應(yīng)用前景。

[1]Xiao Y，Cui J，Li Y X，et al.Dyslipidemic high-fat diet affects adversely bone metabolism in mice associated with impaired antioxidant capacity[J].Nutrition，2011，27（2）：214-220.

[2]Pirih F，Lu J，Ye F，et al.Adverse effects of hyperlipidemia on bone regeneration and strength[J].Journal of Bone and Mineral Research，2012，27（2）：309-318.

[3]Tian J，Dang H N，Yong J，et al.Oral treatment with γ-aminobutyric acid improves glucose tolerance and insulin sensitivity by inhibiting inflammation in high fat diet-fed mice[J].PloS One，2011，6（9）：e25338.

[4]Xie Z，Xia S，Le G W.Gamma-aminobutyric acid improves oxidative stress and function of the thyroid in high-fat diet fed mice [J].Journal of Functional Foods，2014（8）：76-86.

[5]Muhammad S I，Maznah I，Mahmud R，et al.Upregulation of genes related to bone formation by γ-amino butyric acid and γoryzanol in germinated brown rice is via the activation of GABAB-receptors and reduction of serum IL-6 in rats[J].Clinical Interventions in Aging，2013（8）：1259.

[6]Rojo A I，Sagarra M R，Cuadrado A.GSK-3βdown-regulates the transcription factor Nrf2 after oxidant damage：relevance to exposure of neuronal cells to oxidative stress[J].Journal of Neurochemistry，2008，105（1）：192-202.

[7]Jain A K，Jaiswal A K.GSK-3β acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（22）：16502-16510.

[8]Lu F F，Su P，Liu F，et al.Activation of GABAB receptors inhibits protein kinase B/Glycogen Synthase Kinase 3 signaling[J]. Molecular Brain，2012，5（1）：41.

[9]Takahata Y，Takarada T，Hinoi E，et al.Osteoblastic γ-aminobutyric acid，type B receptors negatively regulate osteoblastogenesis toward disturbance of osteoclastogenesis mediated by receptor activator of nuclear factor κB ligand in mouse bone[J].Journal of Biological Chemistry，2011，286（38）：32906-32917.

[10]朱琳玲.骨膠原肽對高脂膳食小鼠抗氧化能力及皮膚和骨骼膠原代謝的影響[D].無錫：江南大學(xué)食品學(xué)院，2012.

[11]Eastell R，Hannon R A.Biomarkers of bone health and osteoporosis risk[J].Proceedings of the Nutrition Society，2008，67：157-162.

[12]Murad R，Qadir M，Khalil R，et al.Association of Urinary calcium and phosphate with bone mineral density among postmenopausal women[J].Biomedica，2012，28：78-81.

[13]Deng Y，Xu L，Zeng X，et al.New perspective of GABA as an inhibitor of formation of advanced lipoxidation end-products：it's interaction with malondiadehyde[J].Journal of Biomedical Nanotechnology，2010（6）：318-324.

[14]Rana T，Schultz M A，F(xiàn)reeman M L，et al.Loss of Nrf2 accelerates ionizing radiation-induced bone loss by upregulating RANKL [J].Free Radical Biology and Medicine，2012，53（12）：2298-2307.

[15]Surh Y J，Kundu J K，Na H K.Nrf2 as a master redox switch in turning on the cellular signaling involved in the induction of cytoprotective genes by some chemopreventive phytochemicals[J].Planta Medica，2008，74：1526.

[16]Winnock F，Ling Z，De Proft R，et al.Correlation between GABA release from rat islet β-cells and their metabolic state[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism，2002，282：937-942.

Effect of γ-Aminobutyric Acid on Bone Performance in High-Fat-Diet-Fed Mice

TIAN Yingjie1， SUN-Jin1，2， XIE Zhenxing1， MA Yuhua1， LE Guowei1，2， SHI Yonghui*1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This manuscript was aimed to investigate the effect of γ-aminobutyric acid on bone performace in high-fat-diet-fed mice.For this，6-week-old C57BL/6 male mice（40）were randomly divided into four groups：normal diet group（C），high-fat diet group（HFD），mice in HFD supplemented with 0.06%，0.12%GABA by drinking water.A week prior to sacrifice，mice were placed in metabolism cages to collect urine for measuring urinary calcium and hydroxyproline content.Mice were sacrificed by 20th，femur，tibia were collected for measuring parameters，femoral oxidative stress and relative genes expression by RT-PCR.The results demonstrated compared withthe control group，HFD showed femoral oxidative stress，down-regulated GAD65 and increased GABAbR1 expression as well as dramatically significantly up-regulated GSK3β and down-regulated Nrf2；In addition，mice in HFD showed significantly reduced femoral and tibial performance，while dramatically increased urinary calcium and hydroxyproline content.At the same time，osteoblastspecific genes Col1a1，BGLAP2 significantly down-regulated while osteoclast-specific genes expression RANKL/OPG，TRAP，CTSK increased significantly in HFD.0.06% ，0.12%GABA supplement can significantly recovered GSK3β，Nrf2，GABAbR1 expression，alleviated femoral oxidative stress，and thus improved femur and tibia performance accompanied by balanced bone metabolism.Conclusion：GABA can balance bone metabolism and partially recoverbone performance by alleviating oxidative stress.0.12%GABA showed a better effect than 0.06%in adjusting femoral redox state and improving bone performance.

γ-aminobutyric acid，bone performance，high-fat diet，oxidative stress，mice

R 151.2

A

1673—1689（2015）03—0267—07

2014-04-21

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B05）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

*通信作者：施用暉（1955—），女，上海人，農(nóng)學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事營養(yǎng)代謝調(diào)控研究。E-mail：yhshi2009@126.com