李光，路娟，李學蘭，張寧，劉斌，陳曦

·藥物制劑與藥品質量控制·

HPLC法測定腎茶中3種甲氧基黃酮類活性成分*

李光1，2，路娟3，李學蘭1，2，張寧4，劉斌4，陳曦3

(1.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所，景洪 666100；2.云南省西雙版納傣族自治州傣藥南藥重點實驗室，景洪 666100；3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京 100193；4.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，佳木斯 154007)

目的 建立測定腎茶提取物中橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚含量的方法。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法，Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈-0.05%磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫；流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測波長：365 nm，進樣量為10 μL。結果 橙黃酮在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素-5-甲醚在0.05～0.50 μg范圍內具有良好的線性關系；平均加樣回收率分別為101.26%，100.28%和99.66%。RSD分別為1.73%，0.82%和1.68%。結論 該方法簡便、準確，可用于腎茶的質量評價。

腎茶；色譜法，高效液相；橙黃酮；半齒澤蘭素；半齒澤蘭素-5-甲醚

腎茶(又名貓須草，傣藥名為雅糯渺)來源于Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li(又稱Orthosiphonstamineus)的全草，是傣醫(yī)常用的排解人體內積蓄毒素的藥物，具有清熱解毒、利水消腫、利尿化石等功能，是傳統(tǒng)傣醫(yī)用于預防和治療腎、膀胱、尿道等泌尿系統(tǒng)感染疾病的首選藥材[1]。現(xiàn)代研究表明，腎茶提取物具有利尿排石[2]、抗氧化[3]、降血壓[4]、保肝[5]等活性，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎茶提取物具有明顯的降血糖[6]、提高半乳糖所致衰老小鼠學習能力[7]等作用，具有較大的應用開發(fā)價值。

腎茶中主要的活性成分是甲氧基黃酮[8-9]，由橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚等組成[10]。甲氧基黃酮類具有明顯的抗氧化[11-12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14]、免疫調節(jié)[15]及保護心血管[16]作用，被譽為“天然抗氧化劑”。目前腎茶質量控制的方法多為測定腎茶中酚酸類成分[17-18]，或者測定甲氧基黃酮類成分[19]，這些方法盡管分離度較好，但出峰時間短，5 min中內全部出峰，對樣品處理要求較高，對于傳統(tǒng)藥物中復雜提取物測定有效成分適用性不高。筆者擬建立一種較為快速測定腎茶中3種主要甲氧基黃酮方法以完善腎茶質量控制，在此基礎上，比較不同產(chǎn)地腎茶中甲氧基黃酮類的含量，為后期產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀(PDA檢測器，Waters ACQUITY UPLC H-CLASS)，AB265-S型分析天平(感量0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司)；優(yōu)普超純水儀。

1.2 試藥 橙黃酮、半齒澤蘭素對照品(含量分別為95.0%，98.3%，批號分別為12101311，10111422)購自百靈威公司，半齒澤蘭素-5-甲醚對照品(含量為98.5%，批號：0305100)購自Indofine Chemical Company；乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為超純水，其他試劑為分析純。腎茶樣品采自云南、福建、廣東、廣西、海南等全國各主產(chǎn)區(qū)，采集時間為2009年9—10月，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所李學蘭研究員鑒定為唇形科腎茶屬Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu植物的地上部分。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05%磷酸鹽緩沖液，洗脫梯度為0～30 min 乙腈濃度為5%→100%，30～40 min 乙腈濃度為100%；流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測波長：365 nm，進樣量為10 μL，樣品經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，各種甲氧基黃酮類成分色譜峰與其他色譜峰基線分離，方法學考察結果顯示此條件適用于腎茶中甲氧基黃酮類的含量測定。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對照品各5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，過孔徑0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取腎茶粉末4.0 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液過孔徑0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.4 線性關系考察 在“2.1”項色譜條件下分別進樣對照品溶液1，2，4，6，8，10 μL，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，建立標準曲線，得到橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對照品的回歸方程分別為Y=323 704X+29 378，r=0.999 5；Y=338 223X+17 097，r=0.999 2；Y=381 229X+709.5，r=0.999 1，顯示橙黃酮在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素-5-甲醚在0.05～0.50 μg范圍內具有良好的線性關系。見圖1。

A.對照品；B.腎茶樣品；1.半齒澤蘭素-5-甲醚；2.橙黃酮；3.半齒澤蘭素

圖 1 兩種溶液的HPLC圖譜

A.reference substance；B.Orthosiphonstamineussample；1.3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone；2.sinensetin；3.eupatorin

Fig.1 HPLC chromatograms of two kinds of solutions

2.5 精密度實驗 精密量取“2.3”項制備供試品溶液10 μL，于“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，分別計算樣品中3種甲氧基黃酮峰面積的RSD。結果表明RSD在0.566%～1.634%，說明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗 按照“2.3”項供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液5份。于“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算樣品中3種甲氧基黃酮含量的RSD。結果表明RSD在1.219%～1.852%，說明實驗重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗 按照“2.3”項制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別于0，2，4，6，8，10 h進樣，計算樣品中3種甲氧基黃酮峰面積RSD。結果表明RSD在1.195%～1.910%，說明供試品10 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的腎茶樣品4.0 g，精密稱定，分別精密加入橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對照品(按純品計算)47.50，78.64，9.85 mg，與樣品混合，按“2.3”項方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進行測定，計算橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚回收率。結果表明平均加樣回收率分別為101.26%，100.28%和99.66%。RSD在0.82%～1.73%，RSD<2%，說明3種甲氧基黃酮類的回收率符合要求。見表1。

2.9 樣品測定 分別取不同產(chǎn)地腎茶按“2.3” 項方法制備供試品溶液并進行測定，結果見表2。

通過測定13份腎茶樣品，3種主要甲氧基黃酮總含量6.23%～9.29%，平均含量為7.82%，白花腎茶的含量為7.45%，紫花腎茶含量為8.40%，紫花腎茶含量普遍較高，并以景洪藥植所的含量最高，為9.29%。

3 討論

腎茶為西雙版納傣族自治州的傣族人常用藥物，平時代茶飲，用于治療腎炎、腎結石等疾病，東南亞地區(qū)居民也習慣應用該藥材，相繼發(fā)現(xiàn)該藥材還具有降血脂及抑菌作用，該藥物保健功能逐漸受到廣泛關注[20]，深入研究其質量控制方法顯得尤為重要。

表1 腎茶樣品中3種甲氧基黃酮類成分加樣回收率Tab.1 Recovery test of three kinds of methoxy flavonoids ingredients in shencha sample

表2 不同產(chǎn)地腎茶中3種甲氧基黃酮類成分含量比較

Tab.2 Comparision of content determination among three kinds of methoxy flavonoids ingredients in Orthosiphon stamineus samples from different habitats %

本實驗建立了同時測定3種主要甲氧基黃酮類成分的方法，能夠實現(xiàn)對腎茶提取物中甲氧基黃酮類成分的同時測定。本實驗結果顯示，紫花腎茶中甲氧基黃酮總含量明顯高于白花腎茶品種，這與之前指紋圖譜[21]測定結果吻合，而且景洪市腎茶含量最高，這可能與該地區(qū)充足的日照條件有關，高日照條件下可刺激植物產(chǎn)生大量的黃酮類次生代謝產(chǎn)物[11]。

[1] 林艷芳，依專，趙應紅.中國傣醫(yī)藥彩色圖譜[M].昆明：云南民族出版社，2003：408-409.

[2] ARAFAT O M，THAM S Y，SADIKUN A，et al.Studies on diuretic and hypouricemic effects ofOrthosiphonstamineusmethanol extracts in rats[J].J Ethnopharmacol，2008，118(3)：354-360.

[3] MATKOWSKI A.Antioxidant activity of extracts and differ-ent solvent fractions ofGlechomahederaceaL.andOrthosiphonstamineus(Benth.)Kudo[J].Clin Exp Med，2008，17(6)：615-624.

[4] AZIZAN N A，AHMAD R，MOHAMED K，et al.Theinvivoantihypertensive effects of standardized methanol extracts ofOrthosiphonstamineuson spontaneous hypertensive rats： a preliminary study[J].African J Pharm Pharmacol，2012，6(6)：376-379.

[5] ALSHAWSH M A, ABDULLA M A, ISMAIL S, et al.Hepatoprotective effects ofOrthosiphonst-amineusextract on thioacetamide-induced liver cirrhosis in rats[J].Evid Based Complement Alternat Med，2011，doi：10.3390/molecules17055385.

[6] 李光，陳曦，路娟，等.腎茶水提物噴干粉對鏈脲霉素所致糖尿病大鼠降血糖作用機制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013(12)：3653-3656.

[7] 汪澤棟，李宜航，陳曦，等.腎茶水提物噴干粉對D-半乳糖所致衰老小鼠學習記憶功能的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013(12)：1649-1652.

[8] LYCKANDER I M，MALTERUD K E.Lipophilic flavonoids fromOrthosiphonspicatusprevent oxidative inactivation of 15-lipoxygenase[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1996，54(4)：239-246.

[9] OLAH N K，RADU L，MOGOSAN C，et al.Phytochemical and pharmacological studies onOrthosiphonstamineusBenth.(Lamiaceae)hydroalcoholic extracts[J].J Pharm Biomed Anal，2003，33(1)：117-123.

[10] AKOWUAH G A，ZHARI I，NORHAYATI I，et al.Sinen-setin，eupatorin，3'-hydroxy-5，6，7，4'-tetramethoxyflavone and rosmarinic acid contents and antioxidative effect ofOrthosiphonstamineusfrom Malaysia[J].Food Chem，2004，87(4)：559-566.

[11] FARHAN M，RAZAK S A，PIN K Y，et al.Antioxidant activity and phenolic content of different parts ofOrthosiphonstamineusgrown under different light intensities.[J].J Tropical Forest Sci，2012，24(2)：173-177.

[12] 單楊，李高陽，李忠海.柑橘皮中多甲氧基黃酮的體外抗氧化活性研究[J].食品科學，2007，28(8)：100-103.

[13] AKAO Y，OHGUCHI K，IINUMA M，et al.Interactive effe-cts of polymethoxy flavones fromCitruson cell growth inhibition in human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J].Bioorg Med Chemist，2008，16(6)：2803-2810.

[14] 張金杰，陳宇峰，顏鳴，等.野菊花中的黃酮類化學成分[J].醫(yī)藥導報，2013，32(1)：15-18.

[15] MANTHEY J A，BENDELE P.Anti-inflammatory activity of an orange peel polymethoxylated flavone，3′，4′，3，5，6，7，8-heptamethoxyflavone，in the rat carrageenan/paw edema and mouse lipopolysaccharide-challenge assays[J].J Agric Food Chem，2008，56(20)：9399-9403.

[16] GREEN C O，WHEATLEY A O，HANCHARD B，et al.His-topathological alterations in organ structures of hypercholesterolemic rats fed ortanique peel polymethoxylated flavones[J].Basic Appl Pathol，2011，4(3)：71-77.

[17] 張麗麗，敬應春，彭崇勝，等.HPLC 法測定不同產(chǎn)地傣藥腎茶中的迷迭香酸[J].中成藥，2011，33(8)：1378-1381.

[18] 康紹建，侯安國，沈妍.傣藥腎茶中熊果酸的含量測定[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(7)：54-56，96.

[19] HUSSIN M E A，YAM M F，ANG L F，et al.A simple iso-cratic HPLC method for the simultaneous determination of sinensetin，eupatorin，and 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone inOrthosiphonstamineusextracts[J].J Acupunct Merid Studies，2012，5(4)：176-182.

[20] SON J Y，PARK S Y，KIM J Y，et al.Orthosiphonstamineusreduces appetite and visceral fat in rats[J].J Korean Soc Appl Biolog Chemist，2011，54(2)：200-205.

[21] 李光，陳曦，李宜航，等.不同產(chǎn)地腎茶HPLC指紋圖譜研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15(6)：448-451.

Determination of Three Active Flavones in Orthosiphon stamineus by HPLC

LI Guang1，2，LU Juan3，LI Xuelan1，2，ZHANG Ning4，LIU Bin4，CHEN Xi1，3

(1.YunnanBranch，InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Jinghong666100 ，China;2.KeyLaboratoryofDaiandSouthernMedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture，YunnanProvince，Jinghong666100 ，China;3.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;4.JiamusiCollege，HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective To develop a method for content determination of sinensetin，eupatorin，and 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone inOrthosiphonstamineus. Methods The determination was carried out on a Symmetry C18column (4.6 mm×250 mm，5 μm) by HPLC.The mobile consisted of acetonitrile and water containing 0.05% H3PO4in gradient elution.The flow rate was 1 mL·min-1，the column temperature was 35 ℃，the detected wavelength was set at 365 nm, and the injection volume was 10 μL. Results The peak areas and the sample quantity of the three components presented good linear relationship in the range of 0.50-5.00 μg for sinensetin，0.50-5.00 μg for eupatorin，and 0.05-0.50 μg for 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone.The average recoveries were 101.26%，100.28% and 99.66%，respectively. RSD were 1.73%, 0.82% and 1.68%, respectively. Conclusion The method is proved to be simple，accurate and can be used for the quality evaluation ofOrthosiphonstamineus.

Orthosiphonstamineus; Chromatography，high performance liquid; Sinensetin; Eupatorin; 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone

2014-04- 03

2014-11-14

*北京協(xié)和醫(yī)學院協(xié)和青年基金資助項目(3332013081，33320140076)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務基金資助專項(YZYN-14-02、YZYN-13-02)；黑龍江省自然科學基金面上項目(H201328)

李光(1985-)，男，河北安國人，助理研究員，碩士，從事民族藥藥理及開發(fā)工作。電話：0691-2136981，E-mail：lhbg311@hotmail.com。

陳曦(1973-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，副研究員，博士，從事中藥藥理及開發(fā)工作。電話：010-62799771，E-mail：91chenxi12@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)09-1203-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.023