曲友直，段君民，曹 鵬，拓 柯，楊 棟

黃芪甲苷對腦缺血再灌注后腦組織MPO活性及 TNF-α、IL-1β含量的影響

曲友直1，段君民2，曹 鵬2，拓 柯2，楊 棟2

目的 探討黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)含量的影響。方法 將36例只SD大鼠物隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷治療組，每組12只。采用分光光度法及酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測各組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，黃芪甲苷治療組大鼠腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 黃芪甲苷可下調(diào)腦缺血再灌注后MPO活性及TNF-α、IL-1β含量，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護作用。

腦缺血再灌注；黃芪甲苷；髓過氧化物酶；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分[1]。已有研究表明黃芪甲苷具有縮小腦梗死體積、減輕缺血再灌注后腦水腫、抗凋亡等作用，但目前作用機制尚不明確[2-4]。近年來發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因，其核心是中性粒細胞的黏附和浸潤，髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)活性是評價中性粒細胞組織浸潤程度的可靠指標(biāo)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)均為具有多效作用的促炎性細胞因子，是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細胞因子[5，6]。本研究通過觀察黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量的影響，探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷起保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及試劑 成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體重250 g～300 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。黃芪甲苷購于中國藥品生物制品檢定所。MPO測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β定量ELISA測定試劑盒，購于美國BIOSOUCE公司。

1.2 動物分組及模型制備 36只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷治療組(治療組)，每組12只。假手術(shù)組栓線僅插入頸總動脈6 mm，不阻塞大腦中動脈，其余步驟同模型組。模型組參照Zea Longa[7]報道的方法，采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。結(jié)扎大鼠頸總和頸外動脈，自頸總動脈分叉處向頸內(nèi)動脈插入栓線18.5 mm±0.5 mm，阻斷大腦中動脈血流，造成局灶性腦缺血，術(shù)后將栓線尾部置于皮下，缺血1.5 h后輕拔栓線造成血流再灌注24 h，再灌注即刻經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水。黃芪甲苷治療組造模后再灌注即刻經(jīng)腹腔注射黃芪甲苷20 mg/kg。

1.3 MPO活性檢測 再灌注24 h后，每組中隨機取6只大鼠處死，取缺血側(cè)腦組織(假手術(shù)組取假手術(shù)側(cè))超聲粉碎(30 s，3次)，4 ℃10 000 r/min離心15 min，保持溫度25 ℃，取上清液于分光光度計下立即進行掃描，檢測MPO活性。

1.4 TNF-α、IL-1β含量檢 每組中另外6只大鼠再灌注24 h后斷頭取腦，于冰盤上迅速剝離缺血側(cè)大腦皮質(zhì)(假手術(shù)組取假手術(shù)側(cè))，加入生理鹽水勻漿，4 ℃3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β含量。具體操作步驟嚴(yán)格按TNF-α、IL-1β定量ELISA試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織 MPO活性及TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷治療組大鼠腦組織MPO活性、TNF-α及IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注MPO活性及TNF-α、IL-1β含量的影響(x±s)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程。中性粒細胞的黏附和浸潤是炎癥反應(yīng)的核心，其通過多種機制介導(dǎo)缺血再灌注后腦損傷[8]：中性粒細胞黏附、聚集造成微血管阻塞，血流量減少；大量氧自由基產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；釋放細胞毒性蛋白降解細胞外基質(zhì)成分，增加血腦屏障通透性；血管通透性增加、引發(fā)腦水腫。MPO主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中，因此作為中性粒細胞的標(biāo)記物，其活性定量反應(yīng)白細胞浸潤的數(shù)量，是評價中性粒細胞在組織中浸潤程度的可靠指標(biāo)[9]。本實驗結(jié)果顯示，模型組MPO活性較假手術(shù)組顯著升高，表明中性粒細胞浸潤與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切，炎癥反應(yīng)參與了腦缺血再灌注損傷。

本實驗結(jié)果還顯示，腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β含量顯著升高。TNF-α、IL-1β均為具有多效性作用的促炎性細胞因子，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。TNF-α可通過以下幾種途經(jīng)參與腦缺血再灌注損傷[9]：促進炎性趨化因子生成、誘導(dǎo)白細胞聚集；激活腦內(nèi)磷脂酶A2；刺激血管激活因子釋放，增加血腦屏障通透性；刺激血管內(nèi)皮細胞合成和表達白介素-1(IL-1)、IL-8、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等，促進白細胞黏附于毛細血管壁。IL-1β是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細胞因子之一，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，其作用機制主要有以下幾個方面[10]：增加缺血腦組織興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性；增加腦缺血神經(jīng)細胞Ca2+超載；刺激內(nèi)皮細胞表達白細胞黏附因子、白細胞介素-8；誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡基因表達，促進細胞凋亡。

本實驗結(jié)果表明，黃芪甲苷可顯著下調(diào)缺血再灌注后腦組織MPO活性及TNF-α、IL-1β含量。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，常作為黃芪及含黃芪的中成藥定性定量評價指標(biāo)[1]。已有研究表明黃芪甲苷具有降低腦缺血再灌注后自由基含量、抗凋亡、縮小梗死體積、上調(diào)ZO-1及occludin蛋白表達、改善血腦屏障通透性等作用，但目前作用機制尚不完全明確[2-4]。本研究表明黃芪甲苷可通過降低腦缺血再灌注后關(guān)鍵細胞因子TNF-α、IL-1β在腦組織中含量，從而抑制腦組織MPO活性、減少中性粒細胞的黏附和浸潤、保護神經(jīng)細胞及血腦屏障的完整。這可能是黃芪甲苷發(fā)揮對腦缺血再灌注后血腦屏障保護作用的分子機制之一。

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(本文編輯 郭懷印)

Effects of Astragaloside Ⅳ on the Activity of MPO and the Content of TNF-α，IL-1β after Cerebral Ischemia and Reperfusion

Qu Youzhi， Duan Junming，Cao Peng，Tuo Ke，Yang Dong

Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi’an 710038，Shaanxi，China

Objective To investigate the effects of astragaloside Ⅳ on the activity of myeloperoxidase(MPO) and content of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)， interleukin-1 beta(IL-1β) after cerebral ischemia and reperfusion.Methods Thirty-six Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into sham-operated group，model group，astragaloside Ⅳ group.The methods of pectrophotometry and ELISA were respectively used to measure the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β in brains tissue.Results Compared with those in sham-operated group，the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β increased significantly in model group(P<0.01).Compared with those in model group， the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β decreased significantly in astragaloside Ⅳ group (P<0.05).Conclusion Astragaloside Ⅳ can decrease the activity of MPO and the content of TNF-α，IL-1β after cerebral ischemia and reperfusion， and alleviate inflammation reaction which may be one of mechanisms of neuroprotective effects of astragaloside Ⅳ on cerebral ischemia and reperfusion injury.

cerebral ischemia and reperfusion injury；astragaloside Ⅳ；myeloperoxidase；tumor necrosis factor alpha；interleukin-1 beta

國家自然科學(xué)基金項目(No.30600841)

1.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院(西安 710038)，E-mail：quyouzhi210@163.com；2.中國人民解放軍第五三八醫(yī)院

R741 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．14．012

1672-1349(2015)14-1620-02

2015-02-02)