晏建新，王曉麗

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴陽(yáng) 550001)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黔產(chǎn)金櫻子多糖超聲提取工藝*

晏建新1，2，王曉麗1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴陽(yáng) 550001)

目的 優(yōu)化黔產(chǎn)金櫻子多糖的超聲提取工藝和條件。方法 以液料比、提取時(shí)間和提取溫度為自變量，以黔產(chǎn)金櫻子多糖的提取率為因變量，對(duì)自變量各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，采用響應(yīng)面法優(yōu)選工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果 黔產(chǎn)金櫻子多糖優(yōu)選工藝：液料比30：1( mL：g)，提取時(shí)間60 min，提取溫度75 ℃，平均提取率37.54%。結(jié)論 優(yōu)化的超聲提取工藝和條件簡(jiǎn)便可靠。

金櫻子，黔產(chǎn)；多糖；超聲提??； 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

金櫻子為薔薇科植物金櫻子(RosalaevigataeMichx)的干燥成熟果實(shí)[1]，在我國(guó)西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州省分布廣，產(chǎn)量高[2]。金櫻子主要活性成分為金櫻子多糖(RosaLaevigataeMichx polysaccharide,RP)，鑒于多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理作用[3]。響應(yīng)面法( response surface methodology，RSM) 是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)優(yōu)選工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[4]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)是近年常用的設(shè)計(jì)方法，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法(CCD-RSM)比正交實(shí)驗(yàn)法更加簡(jiǎn)化，比均勻設(shè)計(jì)法更加全面，其實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，實(shí)驗(yàn)精度高[5]，在中藥提取中也有重大應(yīng)用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)引入CCD-RSM對(duì)金櫻子多糖的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定金櫻子多糖提取率，優(yōu)選超聲提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料 金櫻子采自貴州省遵義縣團(tuán)溪鎮(zhèn)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王曉麗教授鑒定為薔薇科植物金櫻子的成熟果實(shí)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904)，濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇均為分析純，水為重蒸水。

1.2 儀器 SK3300H型超聲清洗儀(上海超聲設(shè)備有限公司)，UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本津島)，F(xiàn)A2004分析天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，感量：0.1 mg)，HH-2恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.051 6 g，置100 mL量瓶中溶解后定容，搖勻后濃度為0.516 mg·mL-1。

2.2 供試品溶液的制備 金櫻子樣品處理后置60 ℃恒溫烘箱中烘干，自然冷卻后粉碎過(guò)內(nèi)徑0.250 mm(60目)篩，干燥后[8]備用。稱取上述干燥后樣品按一定比例加重蒸水按不同條件超聲提取[9]，濾過(guò)。取續(xù)濾液，稀釋一定倍數(shù)，備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別置50 mL量瓶中，均稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取上述溶液2.0 mL置具塞試管中，各加4%苯酚1 mL，混勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，混勻，置40 ℃水浴中加熱30 min，取出后冰水浴中放置5 min，在波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度[9]，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=12.337X+ 0.090 2，r=0.999 0，其中Y為溶液質(zhì)量濃度(mg· mL-1)，X為吸光度。線性范圍為5.16～25.80 μg·mL-1。

2.4 金櫻子多糖的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取金櫻子的粉末0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法操作。精密吸取供試品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，雙蒸水定容，搖勻，精密量取2.0 mL于具塞試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，在490 nm測(cè)吸光度。多糖提取率(%) =C×V/W×100，式中：C：金櫻子提取液中葡萄糖濃度(mg·mL-1)；V：提取液總體積(mL)；W：金櫻子干粉質(zhì)量(mg)。

2.5 提取工藝優(yōu)化

2.5.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)Design-Expert7.0.0版軟件，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，每因素五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示三因素，α=(23)1/4，以液料比、提取時(shí)間和提取溫度為自變量，金櫻子多糖提取率為因變量進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1，實(shí)驗(yàn)安排見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.5.2 等高線圖和響應(yīng)面圖分析 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析可以得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面圖可以直觀地反映各自變量對(duì)多糖提取率的影響以及各自變量之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見響應(yīng)面曲面圖及等高線圖，見圖1～3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

Tab.2 Optimization and results of central composite design

編號(hào)X1X2X3多糖提取率/%1001.73232.92211135.08301.732033.09400035.22511-128.94600-1.73224.517-11126.888-11-127.029-1.7320024.08101-1130.4611-1-1126.36121-1-127.5813-1-1-125.031400037.031500036.781600036.46171.7320032.261800036.271900037.85200-1.732025.04

從圖1～3可以直觀地看出：料液比對(duì)貴州產(chǎn)金櫻子多糖提取率的影響最大，其描繪得到的曲線較為陡峭；其次是提取時(shí)間的影響，其曲線相對(duì)于料液比而言，相對(duì)平滑一些；影響最小的是溫度，其曲線平滑，反映出的數(shù)值變化不大。按照回歸模型預(yù)測(cè)的超聲提取貴州產(chǎn)金櫻子多糖的優(yōu)選工藝條件是：液料比為35.64(mL：g)，提取時(shí)間為64.29 min，提取溫度75.01 ℃。在此工藝條件下，預(yù)測(cè)提取得到貴州產(chǎn)金櫻子多糖提取率為37.83%。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖1 液料比與提取溫度對(duì)多糖提取率的交互影響

Fig.1 Interation of ratio of water to material and temperature on polysaccharide yeild

圖2 提取時(shí)間與液料比對(duì)多糖提取率的交互影響

Fig.2 Interation of time and ratio of water to material on polysaccharide yeild

圖3 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取率影響的交互影響

Fig.3 Interation of time and temperature on polysaccharide yield

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在優(yōu)選出的工藝條件下，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)取平均值，再與數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，其中實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的偏差表示實(shí)驗(yàn)值偏離預(yù)測(cè)值的程度，其絕對(duì)值越小，說(shuō)明預(yù)測(cè)性越好[11-16]。采用上述優(yōu)選提取條件 (考慮到實(shí)際操作的情況，將多糖優(yōu)選提取條件修正為料液比1：30、超聲時(shí)間為60 min、超聲溫度75 min)，在此工藝條件下重復(fù)操作3次實(shí)際測(cè)得的平均多糖得率為37.54 %，與模型預(yù)測(cè)值的誤差為0.8%。

3 討論

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)影響金櫻子多糖提取的各自變量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，影響程度：料液比>超聲時(shí)間>超聲溫度。利用Dsign-Expert7.0.0版軟件對(duì)進(jìn)行響應(yīng)面分析并建立了顯著影響多糖提取率的二次回歸模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化各自變量水平，探討各自變量間交互作用。試驗(yàn)結(jié)果表明CCD-RSM實(shí)驗(yàn)所得擬合方程可較好地描述多糖提取率與各自變量之間的關(guān)系，所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件重復(fù)性好，參數(shù)真實(shí)可靠，且具有實(shí)際意義。超聲提取應(yīng)用規(guī)模較小，存在消除噪聲方面的問(wèn)題及提取機(jī)理尚不明確?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》中金櫻子多糖的水浴回流法提取工藝步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，而本文應(yīng)用超聲提取快速有效，科學(xué)合理，為金櫻子多糖提取工藝的研究提供新方法，具有實(shí)際的指導(dǎo)意義和良好的應(yīng)用前景，為《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供一定的理論依據(jù)。

采用CCD-RSM對(duì)貴州產(chǎn)金櫻子多糖的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，得到和實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬和程度較高的數(shù)學(xué)模型和較優(yōu)的貴州產(chǎn)金櫻子多糖提取工藝條件。最終結(jié)論為：料液比1：30、超聲時(shí)間為60 min、超聲溫度75 ℃，實(shí)際上金櫻子多糖提取率為37.54%，該工藝簡(jiǎn)便快速可行。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：206.

[2] 劉焱，高智席，李麗，等.金櫻子中蘆丁和槲皮素不同提取方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(8)：4521-4522.

[3] 王恩軍，季文琦，范林林，等.箬葉多糖抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32(5)：586-589.

[4] KLEIJNEN J P C，HERTOG D，ANGUN E，et al.Response surface methodology’s steepest ascent and stepsize revisited Crrection[J].Eur J Operational Res，2006，17(1)：664.

[5] 邱穎，朱玲，孫曉英.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法與正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的比較及其在藥劑研究中的應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2011，23(2)：18-20.

[6] 韓偉，劉傲霞，成悅，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法在中藥提取中的應(yīng)用[J].機(jī)電信息，2013，26(9)：1-5.

[7] 彭曉霞，路莎莎.響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥研究中的應(yīng)用和發(fā)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(19)：296-299.

[8] 徐鵬，胡素蓮，李云耀，等.不同產(chǎn)地金櫻子中多糖和總黃酮的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥師，2012，15(5)：648-650.

[9] 李連芳，王曉麗.貴州產(chǎn)金櫻子多糖的含量測(cè)定[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，38(8)：162-163.

[10] 劉蕓，趙鵬，宋逍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化陜西產(chǎn)重樓多糖提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(9)：1212-1215.

[11] 張囡，康廷國(guó)，尹海波.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化穿龍薯蕷多糖提取工藝[J].中藥材，2011，34(1)：123-126.

[12] 喬?hào)|東，張?jiān)?，尤新軍，?星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化梓樹果實(shí)總黃酮的超聲提取工藝[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(3)：170-174.

[13] 谷麗艷，張立德，張昊，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化健脾益氣湯的提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32(7)：929-933.

[14] 袁玉霞，關(guān)延彬，周寧，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方左氧氟沙星原位凝膠的制備工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(4)：481-484.

[15] 孟江，許舒雅，盧國(guó)勇，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化姜炭炮制工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(2)：8-11.

[16] 陳小云，張振海，金鑫，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化基于納米CaCO3的辣椒素緩釋漂浮微丸制備工藝的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(22)：3400-3404.

Optimization of Ultrasonic Extraction for Polysaccharide from Rosa Laevigatae Michx in Guizhou by Central Composite Design-Response Surface Methodology

YAN Jianxin1,2，WANG Xiaoli1

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004,China；2.DepartmentofPharmacy，GuizhouProvinicalPeople'sHospital，Guiyang550001,China)

Objective To select the optimum ultrasonic extracting method of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou. Methods Independent variables were solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature, dependent variable was extraction rate ratio of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx.Linear or nonlinear mathematic models were used to estimate the relationship between independent and dependent variables.Response surface methodology was used to optimize the process of extraction.Prediction was carried out through comparing the observed and predicted value. Results The optimum extraction condition for the polysaccharides was as follows: extracting at 75 ℃ for 60 min and ratio of liquid to solid 30：1 ( mL：g).The average extraction yield of polysaccharides was 37.54% under the optimum extraction condition. Conclusion This optimized extraction process is simple and reliable for the extraction of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou.

RosaLaevigataeMichx inGuizhou；Polysaccharides；Ultrasonic extraction；Central composite design-response surface methodology

2014-11-17

2015-02-27

*貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合ZY字[2012]3004號(hào))

晏建新(1972-)，女，湖南隆回人，主管藥師，碩士，研究方向：中草藥開發(fā)與應(yīng)用。電話：(0)15761600430，E-mail：850144305@qq.com 。

王曉麗(1956-)，女，貴州貴陽(yáng)人，教授，學(xué)士，研究方向：中草藥開發(fā)與應(yīng)用。電話：(0)18984391719，E-mail： 346195348@qq.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1367-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.028