程佩佩，夏葉，方玉，答國(guó)政，黃靜，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

不同產(chǎn)地及不同藥用部位馬藍(lán)中靛藍(lán)和靛玉紅的含量測(cè)定

程佩佩，夏葉，方玉，答國(guó)政，黃靜，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

目的 建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地、不同藥用部位馬藍(lán)中靛藍(lán)、靛玉紅的含量。方法 選用Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(75：25)，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。結(jié)果 靛藍(lán)在0.051 3～0.820 8 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 3)，平均回收率為99.00%，RSD為1.30%(n=6)。靛玉紅在0.049 5～0.792 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為98.88%，RSD為1.51%(n=6)。結(jié)論 馬藍(lán)中靛藍(lán)、靛玉紅因產(chǎn)地和藥用部位的不同，含量差異較大。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、可靠，可為馬藍(lán)藥材的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

馬藍(lán)；靛藍(lán)；靛玉紅；含量測(cè)定；色譜法，高效液相

馬藍(lán)[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek]為爵床科植物，廣泛分布于我國(guó)西南、華南及華東地區(qū)，是我國(guó)常用藥用植物，其葉經(jīng)加工成干葉后在我國(guó)華南地區(qū)常作大青葉使用[1]；莖、葉加工成一種深藍(lán)色的粉末入藥稱(chēng)為青黛[2]，青黛性寒味咸，具有清熱解毒、涼血止血、清肝瀉火的功效；根及根莖入藥稱(chēng)為南板藍(lán)根[3]，南板藍(lán)根性寒、味苦，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血、消斑的功效，主治溫病發(fā)熱，發(fā)斑，發(fā)疹，風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、流行性感冒、腦脊髓膜炎、乙型腦炎、肝炎、肺炎、腮腺炎、丹毒、癰腫、火眼、神昏吐等癥[4]。馬藍(lán)葉的主要活性成分為靛藍(lán)、靛玉紅等吲哚類(lèi)化合物[5]。靛玉紅具有抗腫瘤作用，是治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效成分[6]，靛藍(lán)既是一種染料又具有保肝作用[7]。馬藍(lán)是一種應(yīng)用較廣泛的藥用植物，由于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量低，過(guò)量采挖等因素導(dǎo)致其野生資源急劇減少，市場(chǎng)上充斥著來(lái)源于其同科屬的偽品，如球花馬藍(lán)、廣西馬藍(lán)等[8]，由于這些偽品的原植物形態(tài)與正品馬藍(lán)較相似，易于混淆，嚴(yán)重影響臨床用藥安全。偽品因不含有效成分靛藍(lán)、靛玉紅，故不能與正品馬藍(lán)混用[8]。為了有效控制馬藍(lán)相關(guān)藥材的質(zhì)量，筆者建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定不同地區(qū)馬藍(lán)根、莖、葉中主要活性成分靛玉紅、靛藍(lán)的含量[9-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEX P680高效液相色譜儀(美國(guó)DIONEX公司)；SHIMADZU UV-1800 分光光度計(jì)(日本島津公司)；十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士Metiler Toledo公司)；KQ-250B超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 靛藍(lán)對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YM0306SA14，含量≥98%)；靛玉紅對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20121023，含量≥98%)；甲醇(色譜純)；N，N-二甲基甲酰胺(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；水為重蒸餾水。樣品共15批，見(jiàn)表1，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室張秀橋教授鑒定，為爵床科植物馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia)的根、莖、葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 采用Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水=(75：25)；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；進(jìn)樣量20 μL。靛玉紅、靛藍(lán)理論板數(shù)均>4 000，兩組份之間及與其他峰分離度>5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取干燥至恒重的靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)照品1.28，1.24 mg，置于25 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，制成每毫升含靛藍(lán)和靛玉紅0.051 3，0.049 5 mg的溶液，作對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，置5 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，即得各對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 馬藍(lán)樣品用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)內(nèi)徑0.425 mm(40目)篩。取干燥至恒重樣品約75 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中；加N，N-二甲基甲酰胺適量，超聲處理30 min，冷卻；加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，濾過(guò)；取續(xù)濾液，用內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻。分別按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，靛藍(lán)：Y=16.954X+0.005 9，r=0.999 7，線性范圍是0.051 3～0.820 8 μg；靛玉紅：Y=52.978X-0.135 4，r=0.999 9，線性范圍是0.049 5～0.792 0 μg。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。靛藍(lán)、靛玉紅峰面積的RSD分別為2.26%和0.86%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S6號(hào)樣品1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅的峰面積RSD分別為1.78%和1.90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好 。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S6號(hào)樣品6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定靛藍(lán)、靛玉峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。靛藍(lán)、靛玉峰含量的RSD分別為1.20%和1.57%，表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知靛藍(lán)、靛玉紅含量的S6號(hào)樣品6份，每份約75 mg，精密稱(chēng)定，分別準(zhǔn)確加入靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定靛藍(lán)、靛玉峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 靛藍(lán)和靛玉紅加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery results of indigo and indirubin

2.8 樣品含量測(cè)定 取不同來(lái)源、不同藥用部位的樣品粉末各75 mg，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅峰面積，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地及不同藥用部位馬藍(lán)中靛藍(lán)與靛玉紅含量

Tab.3 Content of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different place and medicinal parts

mg·g-1

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版青黛、大青葉中靛藍(lán)、靛玉紅的含量測(cè)定方法[2]，靛藍(lán)的檢測(cè)波長(zhǎng)為606 nm，靛玉紅的檢測(cè)波長(zhǎng)292 nm，但靛藍(lán)在289 nm處有最大吸收[11]，為了便于操作，在同一檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定兩種成分，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇 筆者在本實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果兩系統(tǒng)均能得到較好的峰形，乙腈-水系統(tǒng)10 min內(nèi)出峰完全，甲醇-水系統(tǒng)15 min內(nèi)出峰完全，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇甲醇-水系統(tǒng)更為合適。此外，比較兩種比例甲醇-水系統(tǒng)(75：25)及(70：30)，結(jié)果以甲醇：水為(75：25)時(shí)，峰形更好。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 由于靛藍(lán)、靛玉紅結(jié)構(gòu)相似，可以采用適當(dāng)方法同時(shí)提取。本文比較3種提取方法即N，N-二甲基甲酰胺超聲提取、三氯甲烷超聲提取及三氯甲烷索氏提取器提取，結(jié)果三氯甲烷超聲提取法提取不夠完全，提取時(shí)間較長(zhǎng)，不適合作為本文含量測(cè)定提取方法；三氯甲烷索氏提取器提取可以有效提取靛藍(lán)和靛玉紅，但其耗時(shí)太久，操作繁瑣，亦不適合。經(jīng)過(guò)考察溶劑量、提取時(shí)間等因素，并參考文獻(xiàn)[12]，確定前文供試品制備方法為最佳提取方法。

3.4 不同藥用部位中靛藍(lán)與靛玉紅的含量分析 馬藍(lán)不同藥用部位的靛藍(lán)與靛玉紅含量存在較大差異，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明來(lái)自河南南陽(yáng)、海南興隆、華南植物園及重慶的馬藍(lán)中靛藍(lán)與靛玉紅含量均為葉>莖，廣州的馬藍(lán)根中的靛藍(lán)與靛玉紅含量幾乎不能檢出。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11，13-15]，發(fā)現(xiàn)馬藍(lán)根中的靛藍(lán)、靛玉紅含量均較低，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于莖葉中含量；由于本實(shí)驗(yàn)中供試品溶液制備的取樣量均為75 mg，對(duì)根而言相對(duì)偏低，故來(lái)源于廣州的S12和S13樣品中靛藍(lán)、靛玉紅可能由于含量低于檢測(cè)限度而未能被檢出。

3.5 不同產(chǎn)地樣品中靛藍(lán)與靛玉紅的含量分析 由于馬藍(lán)的分布范圍較廣，不同產(chǎn)地馬藍(lán)的靛藍(lán)與靛玉紅含量不同。筆者考察馬藍(lán)6個(gè)來(lái)源地樣品中，來(lái)自海南興隆(S4號(hào)樣)馬藍(lán)葉中靛藍(lán)含量最高，而來(lái)自廣西(S6號(hào)樣)馬藍(lán)葉則靛玉紅含量最高。不同產(chǎn)地馬藍(lán)葉中靛玉紅的含量均高于《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部大青葉項(xiàng)下含量測(cè)定對(duì)靛玉紅含量(不少于0.020%)的要求，說(shuō)明我國(guó)南方將馬藍(lán)葉作為大青葉使用有一定的科學(xué)性。此外，還對(duì)來(lái)自廣東和廣西的多批球花馬藍(lán)葉進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果均未檢出靛藍(lán)和靛玉紅，進(jìn)一步驗(yàn)證球花馬藍(lán)等偽品不可與馬藍(lán)混用。

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Determination of Indigo and Indirubin in Baphicacanthus cusia from Different Producing Areas and Medicinal Parts by RP-HPLC

CHENG Peipei, XIA Ye, FANG Yu, DA Guozheng, HUANG Jing, ZHANG Xiuqiao

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China)

Objective To establish a RP-HPLC method for determining indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different producing areas and medicinal parts. Methods The separation was achieved by an Agilent TC-C18Column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 25 ℃ using methanol-water (75：25) as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was 290 nm. Results Indigo had a good linear relationship with peak area at range of 0.051 3-0.820 8 μg (r=0.999 3).The recovery rate was 99.01% and RSD was 1.30% (n=6).Indirubin had a good linear relationship with peak area at range of 0.049 5-0.792 0 μg (r=0.999 9).The recovery rate was 98.88% and RSD was 1.51% (n=6). Conclusion The contents of the two components are obviously different inBaphicacanthuscusiabecause of different places or medicinal parts.The proposed method is simple, rapid and reliable.This method for determination of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiaby RP-HPLC provides a basis for quality control ofBaphicacanthuscusia.

Baphicacanthuscusia；Indigo；Indirubin；Content determination；Chromatography, high performance liquid

2014-06-30

2014-09-23

程佩佩(1988-)，女，湖北仙桃人，在讀碩士，主要從事中藥資源、品質(zhì)及開(kāi)發(fā)研究工作。電話：(0)13343581351，E-mail：1173814267@qq.com。

張秀橋(1965-)，女，河北新樂(lè)人，教授，博士，主要從事中藥品種、質(zhì)量及資源開(kāi)發(fā)研究工作。電話：(0)13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com。

R281.1；R927.2

B

1004-0781(2015)10-1363-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.027