王儷甌，楊娟艷，茅向軍，楊微微，羅奕

一測多評法同時測定金喉健噴霧劑中4種有效成分*

王儷甌1，楊娟艷3，茅向軍2，楊微微1，羅奕1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州省食品藥品檢驗所，貴陽 550004；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002)

目的 建立一測多評法的方法學(xué)考察模式，驗證其在金喉健噴霧劑中應(yīng)用的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。方法 采用氣相色譜法，以萘為內(nèi)標物，以薄荷腦為參照物，建立該成分與1，8-桉葉素，樟腦，龍腦的相對校正因子，并用該校正因子進行4種有效成分的含量測定，實現(xiàn)一測多評，同時采用對一測多評計算值與內(nèi)標法實測值的進行比較，以驗證一測多評法的準確性。結(jié)果 所建立的校正因子重復(fù)性良好，10批產(chǎn)品中4個指標成分的含量計算值與內(nèi)標法實測值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 一測多評法作為一種新的質(zhì)量評價方法用于金喉健噴霧劑4種有效成分含量測定是可行的、準確的。

金喉健噴霧劑；一測多評法；校正因子，相對；含量測定

金喉健噴霧劑是以苗藥為基礎(chǔ)制備而成的中藥復(fù)方制劑，處方由艾納香油、大果木姜子油、薄荷腦(menthol)、甘草酸單銨鹽組成。主要功效祛風(fēng)解毒、消腫止痛、清咽利喉，其中艾納香油和大果木姜子油中的1，8-桉葉素(1，8-cineole)，樟腦(camphor)，龍腦(borneol)均為活性藥理成分，原標準僅有以龍腦和薄荷腦的含量測定[1]。但是中藥多成分、多功效的作用特點決定著單一成分或指標評價難以表達中藥的質(zhì)量，并由此提出多成分質(zhì)量控制的模式。為了客觀評價金喉健噴霧劑的質(zhì)量，筆者采用氣相色譜(gas chromatography，GC)法對兩種以原料藥的揮發(fā)油提取物投料的主藥成分同時進行分離與檢測，測定1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦4種有效成分含量，并且引入“一測多評”法[2]以薄荷腦對照品為指標成分，建立1，8-桉葉素，樟腦，龍腦與薄荷腦的相對校正因子進行含量測定。目前 “一測多評”法應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑較多使用的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定[3-9]，GC法測定僅有一篇報道[10]。筆者采用GC法將“一測多評”的方法應(yīng)用于金喉健噴霧劑的質(zhì)量控制中，對不同品牌的色譜柱進行考查，探討一測多評法在金喉健噴霧劑質(zhì)量評價中應(yīng)用的可行性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ailgent 7890N氣相色譜儀，Ailgent 7693自動進樣裝置，氫火焰化檢測器，XS205型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.01 mg)。

1.2 試藥 1，8-桉葉素對照品(批號：C004G005，含量99.0%)，樟腦對照品(批號：110747-201409，含量：98.7%)，薄荷腦對照品(批號：110728-200506，含量100.0%)，龍腦對照品(批號：110881-201107，含量：99.3%)，均購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量≥98%；萘(湘中地質(zhì)實驗研究所)、無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)均為分析純，金喉健噴霧劑樣品由貴州宏宇藥業(yè)提供(批號：141019，141020，141021，141022，141042，141043，141044，141045，141047，141049)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 DB-WAX毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為氮氣，流速：12 mL·min-1；氫氣40 mL·min-1；空氣400 mL·min-1，柱流量1 mL·min-1；進樣口溫度為220 ℃；火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)溫度240 ℃，分流進樣，分流比為10：1；進樣量1 μL；程序升溫：初始50 ℃，維持10 min，以3 ℃·min-1升至120 ℃，維持5 min；內(nèi)標法。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取萘13.914 4 g，置50 mL量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取5 mL至25 mL量瓶，用無水乙醇稀釋至刻度，制成濃度為2.783 mg·mL-1內(nèi)標溶液

2.2.2 對照品溶液配制 精密稱取1.8-桉葉素17.24 mg，樟腦26.81 mg，薄荷腦124.5 mg，龍腦對照品72.8 mg，置于5 mL量瓶，加無水乙醇溶解并定容，制成濃度分別為1，8-桉葉素3.413 5 mg·mL-1，樟腦5.292 3 mg·mL-1，薄荷腦24.9 mg·mL-1，龍腦14.458 mg·mL-1的單一對照品溶液。

2.2.3 混合對照溶液配制 精密稱取1.8-桉葉素11.98 mg，樟腦14.10 mg，薄荷腦28.51 mg，龍腦對照品11.11 mg，置于10 mL量瓶，加無水乙醇溶解并定容，制成濃度分別為1，8-桉葉素1.186 mg·mL-1，樟腦1.392 mg·mL-1，薄荷腦2.85 mg·mL-1，龍腦1.103 mg·mL-1；各精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，再精密加入上述內(nèi)標溶液1 mL配制成濃度為1，8-桉葉素0.237 mg·mL-1，樟腦0.278 mg·mL-1，薄荷腦0.57 mg·mL-1，龍腦0.221 mg·mL-1，萘0.557 mg·mL-1混合標準溶液。

2.2.4 供試品的制備 精密量取金喉健噴霧劑2 mL，精密加入上述內(nèi)標溶液1 mL置于5 mL量瓶，加無水乙醇至刻度即得。

2.2.5 陰性樣品的制備 按處方量制備缺艾納香油，大果木姜子油，薄荷腦的陰性供試品，再按供試品制備項下制備成陰性樣品。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 在“2.1“項色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀中，測定，結(jié)果見圖1，實驗結(jié)果表明各色譜峰分離度良好，陰性供試品溶液無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2“項下1，8-桉葉素對照品、樟腦對照品0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 mL，薄荷腦、龍腦對照品0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL，分別置于5 mL量瓶中，分別精密加入上述內(nèi)標溶液1 mL，加無水乙醇至刻度，搖勻，制成標準系列溶液。分別精密吸取系列對照品溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以對照品溶液與內(nèi)標溶液的濃度比值為橫坐標，峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程(表1)。結(jié)果表明1，8桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦在各自相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均呈出良好的線性關(guān)系。

1.1，8-桉葉素；2.樟腦；3.薄荷腦；4.龍腦；5.萘

圖1 陰性樣品(A)對照品(B)和樣品(C)GC色譜圖

1.1,8-cineole;2.camphor;3.menthol;4.borneol;5.naphthalene

Fig.1 GC chromatogram of negative sample (A), control (B) and sample (C)

表1 4種成分的回歸方程和線性范圍

Tab.1 Regression equation and linear range of four ingredients

成分回歸方程r線性范圍/(mg·mL-1)1,8-桉葉素Y=1.4922X+0.00350.99980.034^0.410樟腦Y=1.439X-0.00030.99970.053^0.635薄荷腦Y=1.4085X+0.00330.99990.996^4.980龍腦Y=1.4587X-0.01390.99990.578^2.892

2.5 儀器精密度 取“2.2.4”項下對照品混合溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算各化合物峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦的RSD分別為0.31%，0.12%，0.08%，0.07%，表明儀器精密度結(jié)果良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，在前述色譜條件下分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣測定，記錄峰面積，計算各化合物峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦RSD值分別為0.96%，0.78%，0.77%，0.66%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一批樣品6份，分別按供試品制備方法制備供試品溶液，計算各化合物峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD，1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦RSD分別為1.01%，0.92%，0.95%，0.83%。表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收實驗 精密量取1 mL已知含量的同一批樣品9份，分別按已知質(zhì)量分數(shù)的80%，100%，120% 3個水平加入1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦對照品溶液，按“2.2.2”項制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結(jié)果1，8-桉葉素、樟腦、薄荷腦、龍腦平均回收率分別為99.0%，99.0%，102.5%，100.6%，RSD分別為2.42%，0.84%，2.31%，2.91%。見表2。

2.11 校正因子重復(fù)性考察

2.11.1 不同色譜柱考察 精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液(n=4)，在上述色譜條件下分別進樣1 μL，在同一臺儀器上分別考察DB-WAX毛細管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；Rtx R-WAX毛細管柱(30 m×0.53 mm，1 μm)；Elite-WAX毛細管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)3種不同廠家色譜柱，計算各化合物校正因子。結(jié)果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX的1，8-桉葉素，樟腦，龍腦平均校正因子分別為0.871，0.94，0.95；0.882，0.958，0.951；0.860，0.930，0.974；RSD為1.26%，1.51%，1.42%。

表2 4成分的加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Recovery results of four ingredients

2.11.2 待測組分色譜峰的定位 精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液(n=4)，在上述色譜條件下分別進樣1 μL，在同一臺儀器上考察上述3種色譜柱，利用薄荷腦的相對保留時間，利用待測成分對于薄荷腦保留時間差做為上述待測成分的定位指標，結(jié)果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX 1，8-桉葉素，樟腦，龍腦保留時間差分別為21.82，6.88，2.13；22.95，6.67，2.28，22.91，6.87，2.10；RSD為2.84%，1.77%，4.40%。

2.13 樣品測定 取10批金喉健噴霧劑樣品，按前述所建立的方法分別測定樣品中1，8-桉葉素，樟腦，薄荷腦，龍腦的含量，采用內(nèi)標法和一測多評法計算不同批次的4個成分的含量，結(jié)果見表3。由表3結(jié)果表明，本實驗所建立的內(nèi)標法測定與一測多評法的計算結(jié)果比較無明顯差異，表明一測多評法用于金喉健噴霧劑的多成分質(zhì)量控制是可行的。

表3 金喉健噴霧劑中4種有效成分含量測定結(jié)果

Tab.3 Results of content determination on four ingredients inJinhoujianspray

mg·mL-1，n=2

3 討論

根據(jù)樣品的性質(zhì)，供試品制備方法考察使用水蒸汽蒸餾法和揮發(fā)油提取法[11]，結(jié)果表明水蒸汽蒸餾法和揮發(fā)油提取法提取待測組分有所損失，揮發(fā)油提取法提取的供試品溶液和樣品直接上樣的結(jié)果沒有太大的區(qū)別，從節(jié)約樣品處理時間方面考慮，最終選擇直接使用樣品上樣。

系統(tǒng)適用性實驗中，分別考察不同柱溫(40，50，70，80，100 ℃)及不同流速(1，2，1.0，0.8 mL·min-1)色譜分離情況，升溫程序考察恒溫和程序升溫，結(jié)果表明恒溫目標峰出峰時間太長且薄荷腦與龍腦的峰未得到分離，綜合考慮分離度和分析時間等因素，最終選擇程序升溫，分別考察10 ℃升至180 ℃，5 ℃升至150 ℃，4 ℃升至135 ℃，樟腦，薄荷腦，龍腦都未能與周圍雜質(zhì)峰分離，最終選擇柱溫50 ℃，保持10 min，2 ℃升至120 ℃升溫程序，保持5 min，柱流量1.0 mL·min-1，該色譜條件下4個有效成分均能達到基線分離，滿足含量測定的要求。

內(nèi)標物選擇實驗中，考察萘、正庚烷、環(huán)己酮和水楊酸甲酯等，因樣品中目標峰周圍雜質(zhì)峰較多，結(jié)果選擇萘作為內(nèi)標，因其出峰時間在目標峰之后，且與待測組分的保留時間相近卻能完全分離，且峰周圍無干擾。

本實驗對目標峰的定位除了目標成分峰形判斷外，考察相對保留時間之比和保留時間差來定位，結(jié)果考察不同色譜柱的待測組分保留時間差RSD<5%，使用相對保留時間比定位時，1.8-桉葉素峰的相對保留時間RSD>5%，所以最終選擇采用保留時間差指認其他3個峰的位置。

選擇一測多評內(nèi)標參照物時因薄荷腦對照品含量較高，價格較便宜且易得，故本實驗選用薄荷腦為參照物，由于同時實現(xiàn)4種有效成分的多指標含量測定所用的對照品的量較大，對照品所需費用較高，所以本實驗引入一測多評法于金喉健噴霧劑多指標質(zhì)量評價，實驗證明一測多評所得成分含量的計算值與內(nèi)標法實測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明一測多評法可以應(yīng)用于金喉健噴霧劑多指標的含量測定。

[1] 國家藥品標準.WS-10293(ZD-0293)-2002-2012Z[S].

[2] 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2006，31(23)：1925-19281.

[3] 李愛紅，陳偉健，胡文軍.“一測多評”法測定銀杏葉膠囊中總黃醇苷的含量[J].中國藥房，2012，23(36)：3446-3447.

[4] 李建光 韓松林 趙東升，等.一測多評法測定新疆兩種洋甘菊中5種化學(xué)成分含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(11)：1491-1495.

[5] 孔晶晶，朱晶晶，王智民，等.一測多評技術(shù)在中成藥香連制劑質(zhì)量評價中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2011，36(11)：1445-1448.

[6] 鄒桂欣，尤獻民，張穎，等.“一測多評”法在冠脈康膠囊多種成分檢測中的應(yīng)用研究[J].中國中藥雜志，2008，33(15)：1828-1831.

[7] 楊瀚春，王榮，何家田，等.“一測多評”法測定鎖陽中3種有效成分[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(7)：952-955.

[8] 楊菲，馮偉紅，王智民，等.“一測多評”法測定銀黃制劑中 4 種黃酮類成分含量[J].中國藥學(xué)雜志，2012，47(12)：87-92.

[9] 劉志輝，顧瑋，常星潔，等.“一測多評”法麥貞花顆粒中不同類型成分的含有量[J].中成藥，2012，34(12)：2342-2345.

[10] 付瀅舟，馮有龍，曹玲，等.一測多評法測定速效救心丸中冰片的含量[J].藥物分析雜志，2012，35(2)：775-778.

[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄XD.

Analysis of Four Effective Components in Jinhoujian Spray by Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker

WANG Liou1, YANG Juanyan3, MAO Xiangjun2, YANG Weiwei1, LUO Yi1

(1.CollegeofPharmacy,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China；2.GuizhouProvincialFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China；3.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

Objective To establish a methodological study pattern of quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS), and examine its feasibility and technical applicability in the quality control of compound preparation of traditional Chinese medicine-Jinhoujianspray. Methods Gas chromatographic method (GC) was used and naphthalene served as the internal standard.Menthol was used as the reference substance.The relative correlation factors (RCF) of 1,8-Cineole, camphor and borneol to menthol were calculated and established to carry out QAMS.The accuracy of this method was confirmed by comparison of internal standard method. Results The reproducibility of relative correction factor was perfect.The two methods did not show significant difference in 10 bathes of samples. Conclusion The QAMS method is feasible, credible, and can be used to determine active ingredients inJinhoujianspray.

Jinhoujian spray；Quantitative analysis of multi-components with a single-marker；Correlation factors, relative；Content determination

2014-10-15

2015-01-12

*貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(黔科合中藥字[2012]5030)；貴陽市科技計劃項目(筑科合同[2012204]-1)

王儷甌(1989-)，女，貴州貴陽人，碩士，主要從事藥品質(zhì)量研究。電話：(0)13985548353，E-mail：1195790708@qq.com。

茅向軍(1964-)，男，貴州貴陽人，主任藥師，博士，主要從事藥品質(zhì)量研究。電話：(0)13368610577，E-mail：1074459931@qq.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)10-1356-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.025