周美，陳華國(guó)，周欣，龔小見

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化姜黃中姜黃素提取工藝及其抗氧化活性*

周美1，2，陳華國(guó)1，2，周欣1，2，龔小見1，2

(1.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽(yáng) 550001)

目的 研究姜黃中姜黃素類化合物最佳提取工藝及其抗氧化活性。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)乙醇提取姜黃中姜黃素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)乙醇濃度、溶劑用量、提取溫度、提取時(shí)間等進(jìn)行考察，采用高效液相色譜(HPLC)法比較不同因素對(duì)姜黃素化合物含量變化的影響；以姜黃素類化合物含量及姜黃提取物抗氧化活性為綜合考察指標(biāo)，用DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果 最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度60 %，乙醇用量20倍，回流2 h，提取溫度90 ℃，姜黃素類化合物提取率為3.56%，姜黃提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為79.79%。結(jié)論 該工藝操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，在此條件下獲得的姜黃提取物具有良好的抗氧化活性。

姜黃素；DPPH法；提取工藝；抗氧化活性

姜黃(Curcumin)為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的根莖，具有利膽、通經(jīng)止痛、行氣破瘀、除濕通絡(luò)等功效[1]。姜黃藥材中主要含有姜黃素類、揮發(fā)油類、糖類及甾醇類等化學(xué)成分。其中姜黃素類化合物主要包括醇溶性二苯基庚烴類化合物姜黃素(JⅠ)、脫甲氧基姜黃素(JⅡ)和雙脫甲氧基姜黃素(JⅢ)。同時(shí)，姜黃素是一種理想的天然色素[2-3]，從姜黃中提取姜黃素類化合物是目前的研究熱點(diǎn)之一。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)姜黃中姜黃素類化合物提取工藝研究報(bào)道較多[4-8]。這些研究為合理提取姜黃素類化合物提供了一定科技支撐，但是，這些提取工藝大多采用姜黃素類化合物含量為指標(biāo)，闡述其化學(xué)特征信息，而利用化學(xué)和藥效學(xué)結(jié)合的手段進(jìn)行姜黃素類化合物提取工藝研究筆者尚未見報(bào)道。因此，筆者擬以姜黃素類化合物含量以及姜黃提取物抗氧化活性為綜合考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響提取工藝的主要影響因素進(jìn)行研究，以期獲得能夠同時(shí)兼顧化學(xué)和藥效學(xué)指標(biāo)的工藝參數(shù)，為姜黃藥材的深度開發(fā)利用提供一定科學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)，也為其他天然藥物活性成分的提取提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(包括四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱)；Spectra Max Plus 384 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多集團(tuán)，感量：0.1 mg)；DFY-200高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；EM-202MS1微波真空干燥機(jī)(合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限責(zé)任公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%醋酸溶液(44：56)；檢測(cè)波長(zhǎng)425 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL·min-1[9]，色譜圖見圖1。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取姜黃提取物的浸膏粉末0.1 g，置于50 mL量瓶，用乙醇溶解并定容，搖勻，過內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 姜黃提取物抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 DPPH樣品溶液制備 取DPPH對(duì)照品粉末400 mg，精密稱定，用乙醇配制成0.2 mmol·L-1的溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取姜黃提取物的浸膏粉末0.1 g，置于50 mL量瓶，用乙醇溶解并定容，稀釋為400，200，100，50，25 μg·mL-1等5個(gè)梯度的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 測(cè)定方法 分別精密吸取上述系列梯度濃度的溶液各2 mL至5 mL試管中，再分別精密加入DPPH溶液2 mL，混合均勻，于25 ℃條件下避光保存40 min后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度(Ai)，同時(shí)分別測(cè)定樣品溶液2 mL+無水乙醇2 mL的吸光度(Aj)，無水乙醇2 mL+DPPH溶液2 mL吸光度(A0)，按下式計(jì)算對(duì)自由基的清除率，清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.雙脫甲氧基姜黃素；2.脫甲氧基姜黃素；3.姜黃素

圖1 對(duì)照品(A)與姜黃乙醇提取物(B)的HPLC 圖

1.bisdemethoxycurcumin；2.demethoxycurcumin；3.curcumin

Fig.1 HPLC chromatograms of the reference substances (A) and ethanol extraction ofCurcumalongaL.(B)

2.3 提取工藝優(yōu)化

試驗(yàn)驢采用大欄飼養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由活動(dòng)，每天飼喂4次，飼喂時(shí)間分別為07：00、11：00、17：00、22：00，由專人負(fù)責(zé)飼養(yǎng)與管理，全天自由飲水。期間注意觀察驢的采食規(guī)律、行為表現(xiàn)和健康。

2.3.1 綜合評(píng)分的計(jì)算 采用面積歸一化法對(duì)姜黃素含量及姜黃提取物抗氧化活性進(jìn)行處理，綜合評(píng)分=總含量/最大總含量×0.3+抗氧化活性/最大抗氧化活性×0.7。

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.2.1 乙醇濃度的考察 精密稱取姜黃藥材粉末(過內(nèi)徑0.425 mm篩)10 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入40%，50%，60%，70%，80%濃度的乙醇溶液150 mL，在80 ℃條件下回流提取2 h，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)鼫p壓干燥至恒重。并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)浸膏進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果40%，50%，60%，70%，80%乙醇提取綜合評(píng)分分別為0.481，0.781，0.966，0.958，0.851。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以60%乙醇提取時(shí)綜合評(píng)分最大，故優(yōu)選60%乙醇作為提取溶劑。

2.3.2.2 溶劑用量的考察 精密稱取姜黃藥材粉末(過內(nèi)徑0.425 mm篩)10 g，置具塞錐形瓶中，分別加入10，15，20，25 倍量60%乙醇溶液，在80 ℃條件下回流提取，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)鼫p壓干燥至恒重。并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)浸膏進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果10，15，20，25 倍量60%乙醇溶液提取綜合評(píng)分分別為0.893，0.930，0.958，0.948。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溶劑倍量至15倍以后，隨著溶劑倍量增加，對(duì)綜合評(píng)分影響不大，出于節(jié)約溶劑、降低成本的角度考慮，選擇15 倍量的溶劑體積為最優(yōu)溶劑用量。

2.3.2.3 提取溫度的考察 精密稱取姜黃藥材粉末(過內(nèi)徑0.425 mm篩)10 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇溶液150 mL，分別于70，80，90 ℃下進(jìn)行提取，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)鼫p壓干燥至恒重。并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)浸膏進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果70，80，90 ℃時(shí)提取綜合評(píng)分分別為0.831，0.957，0.933。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度為80 ℃時(shí)，綜合評(píng)分最大，故選取80 ℃為最優(yōu)提取溫度。

2.3.2.4 提取時(shí)間的考察 精密稱取姜黃藥材粉末(過內(nèi)徑0.425 mm篩)10 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇溶液150 mL，分別在80 ℃條件下回流提取1，2，3 h，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)鼫p壓干燥至恒重。并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)浸膏進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果回流提取1，2，3 h的綜合評(píng)分分別為0.946，0.983，0.836。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間2 h效果優(yōu)于1 h，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分有下降的趨勢(shì)，故選取2 h為最優(yōu)提取時(shí)間。

2.3.2.5 提取次數(shù)的考察 精密稱取姜黃藥材粉末(過內(nèi)徑0.425 mm篩)10 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇溶液150 mL，在80 ℃條件下回流提取2 h，分別提取1，2，3 次，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)鼫p壓干燥至恒

重。并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)浸膏進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果提取1，2，3 次的綜合評(píng)分分別為0.983，0.988，1.000。結(jié)果顯示，提取次數(shù)對(duì)提取工藝綜合評(píng)分的影響不大，從方便、省時(shí)、節(jié)能等方面考慮，優(yōu)選提取1 次。

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考查結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)、提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)為考察因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，以綜合評(píng)分為考查指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，提取次數(shù)為1次，每次實(shí)驗(yàn)平行3份，篩選最佳工藝條件，因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

Tab.1 Factors and levels for orthogonal test L9(34)

水平乙醇濃度(A)/%溶劑用量(B)/倍提取溫度(C)/℃提取時(shí)間(D)/h150107012601580237020903

2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 通過直觀分析，影響因素的主次為：乙醇濃度>提取溫度>溶劑用量>提取時(shí)間，最佳提取條件為：A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，溶劑用量為20倍，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為1 h，且提取次數(shù)為一次。為驗(yàn)證直觀分析結(jié)果，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3，結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)提取工藝有顯著性影響，與直觀分析結(jié)果相符。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results for the orthogonal text L9(34)

A.乙醇濃度；B 溶劑用量；C.提取溫度；D.提取時(shí)間；JⅠ.姜黃素； JⅡ.脫甲氧基姜黃素； JⅢ.雙脫甲氧基姜黃素

A.ethanol concentration；B.solvent volume；C.extraction temperature；D.extraction time；curcumin (JⅠ)，demethoxycurcumin (JⅡ)；bisdemethoxycurcumin (JⅢ)

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis

A.乙醇濃度；B 溶劑用量；C.提取溫度；D.提取時(shí)間；F0.05(2，2)=19.00

A.ethanol concentration；B.solvent volume；C.extraction temperature D.extraction time ；F0.05(2，2)=19.00

2.3.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證 由于優(yōu)選的工藝未包含在正交設(shè)計(jì)表的9 次實(shí)驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表 4。用同一批藥材，按條件A2B2C3D1進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，綜合評(píng)分的RSD值為0.5%，表明該工藝重復(fù)性好。

表4 優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果

Tab.4 Verification results of optimum process

%

JⅠ.姜黃素； JⅡ. 脫甲氧基姜黃素； JⅢ.雙脫甲氧基姜黃素

curcumin (JⅠ)；demethoxycurcumin (JⅡ)；bisdemethoxycurcumin (JⅢ)

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，自由基是引起多種疾病和老化的誘因，如癌癥、心血管疾病等[10-13]，因此，抗氧化劑的研究越來越受到高度的重視。本研究以姜黃素類化合物含量以及姜黃提取物抗氧化活性為綜合考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定姜黃最佳提取工藝為乙醇濃度60%，料液比為1：20，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間1 h。在此條件下姜黃素類化合物提取率為3.56%，姜黃提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為79.79%，表明在該工藝條件下姜黃素類化合物具有較高的提取率、姜黃提取物具有較強(qiáng)

的抗氧化活性。但從正交實(shí)驗(yàn)可知，姜黃素含量與抗氧化活性并非呈絕對(duì)線性關(guān)系，但整體上呈正相關(guān)，其作用機(jī)制有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的工藝簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，能為姜黃藥材的綜合開發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Optimized Extraction of Curcuminoids from Curcuma Longa L.by Orthogonal Designed Method and Its Antioxidant Activity

ZHOU Mei1,2, CHEN Huaguo1,2, ZHOU Xin1,2, GONG Xiaojian1,2

(1.KeyLaboratoryforInformationSystemofMountainousAreasandProtectionofEcologicalEnvironment,GuizhouProvince,Guiyang550001,China；2.TheResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China)

Objective To investigate the optimal extraction technique and antioxidant activity of curcuminoids fromCurcumalongaL. Methods The optimized extraction process of curcuminoids fromCurcumalongaL.with ethanol as extracting solvent were studied based on orthogonal test.The effect of each factor such as the ethanol concentration, the amount of solvent, extraction temperature and extraction time were investigated based on a single-factor experiment.The effects of extraction yield of curcuminoids under different processing conditions were compared by HPLC method.Content of curcuminoids and antioxidant activity of the extract were used as comprehensive survey index. Free radical scavenging DPPH method was used to assess the antioxidant effect.And the extraction technique parameters were optimized. Results The condition of optimal extraction technique was: ethanol concentration 60%, amount of solvent 20 folds, extraction time 2 h, extraction temperature 90 ℃. Under these conditions, the extraction yield of curcuminoids was 3.65%.DPPH free radical scavenging yield of the curcumin extract was 79.9%. Conclusion This optimized technology is simple and have a good reappearing rate, and the extracts ofCurcumalongaL.show good antioxidant activity.

Curcuminoids；DPPH radical assay；Orthogonal array design；Antioxidant activity

2014-07-08

2014-10-10

*貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同[2012203]2-15)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(黔科合KY[2012]005)；貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(黔發(fā)改高技[2013]2068號(hào))；貴州省中藥材現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) (GZCYTX-02)。

周美(1987-)，女，貴州畢節(jié)人，碩士，研究方向：中藥質(zhì)量控制。電話：0851-6700414，E-mail：zm19860523@163.com。

周欣(1962-)，女，貴州貴陽(yáng)人，教授，博士，研究方向：中藥、民族藥質(zhì)量控制，中藥指紋圖譜以及中藥新藥研發(fā)。電話：0851-6700494，E-mail：alice9800@sina.com。

R284.2

B

1004-0781(2015)10-1352-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.024