戚志華，郭淑云，唐秀玲，李曉曄，王慶偉

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 710038；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

反相高效液相色譜法測(cè)定根皮苷平衡溶解度與油水分配系數(shù)*

戚志華1，郭淑云1，唐秀玲1，李曉曄2，王慶偉1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 710038；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

目的 建立根皮苷的含量檢測(cè)方法，測(cè)定其在不同溶劑中的平衡溶解度及在正辛醇-水緩沖體系中的油水分配系數(shù)。方法 采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定根皮苷在水和不同溶劑中的平衡溶解度；色譜條件為：Inertsil ODS-3柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，乙腈-0.05%磷酸(30：70)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。采用搖瓶法測(cè)定油水分配系數(shù)。結(jié)果 25 ℃時(shí)根皮苷在水中的平衡溶解度為2.07 mg·mL-1，在甲醇中的溶解性較好，為838.63 mg·mL-1。在0.054 9～1.098 μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=2 152.9X+7.26(r=0.999 9)；根皮苷在醇中的溶解度較高。結(jié)論 根皮苷的RP-HPLC含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，該方法可用于根皮苷溶解度的測(cè)定。根皮苷在石油醚中幾乎不溶，在水中的溶解度較低，在甲醇中的溶解度較高；根皮苷的表觀分配系數(shù)在酸性環(huán)境中變化不大，在堿性條件下隨pH值增加明顯下降。

根皮苷；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)

根皮苷(phloridzin，化學(xué)式：C21H24O10)是根皮素(phloretin)的2’-β”-D-葡萄糖苷，屬于植物黃酮類中的二氫查爾酮苷，主要存在于蘋果屬多種植物中，在根、莖、葉及果實(shí)中均有分布。與其他黃酮類相比，二氫查爾酮苷在自然界很少存在，被稱為少數(shù)黃酮類[1]。根皮苷具有多種生物學(xué)活性，如降血糖、平衡雌激素、保護(hù)心臟及抗氧化等。并且具有低毒的特點(diǎn)，這使其在醫(yī)學(xué)、化妝品、食品、植物組織培養(yǎng)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2-4]。由于根皮苷具有治療糖尿病的作用，歐美國(guó)家已用其生產(chǎn)藥品；而我國(guó)有關(guān)根皮苷的研究不多[5]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定根皮苷在不同溶劑中的平衡溶解度，以及在正辛醇-水緩沖體系中的表觀油水分配系數(shù)，對(duì)其溶解性和滲透性進(jìn)行初步考察，以期為根皮苷的體內(nèi)吸收代謝及其他相關(guān)藥學(xué)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200型液相色譜儀，1200紫外檢測(cè)器；電子分析天平(BP211D型，德國(guó)Sartorius 公司，感量：0.01/0.1 mg)；恒溫水浴振蕩器(SHZ-B型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；離心機(jī)(TGL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 根皮苷對(duì)照品[第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室制備，制備色譜柱YMC-Park R&D ODS-A-column(20 mm×250 mm,5 μm,YMC Co,Ltd.Japan)，經(jīng)紅外、質(zhì)譜鑒定，高效液相色譜法測(cè)得含量為99.3%，批號(hào)：20120626，樣品存放于陰涼干燥處]。乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110712，分析純，含量≥99.5%)，無水甲醇(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2013101501，分析純，含量≥99.5%)，無水乙醇(安徽安特食品股份有限公司，批號(hào)：1311073601，分析純，含量≥99.5%)，石油醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20121226，分析純，含量≥99.5%)，乙醚(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130510，分析純，含量≥99.5%)，正辛醇(天津市恒興化工試劑制造有限公司，批號(hào)：20101109，分析純，含量≥99.5%)，正丁醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130621，分析純，含量≥99.5%)，三氯甲烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20121014，分析純，含量≥99.5%)，乙酸乙酯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130110，分析純，含量≥99.5%)，丙二醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100502，分析純，含量≥99.0%)，丙酮(天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào)：20090312，分析純，含量≥99.7%)，純化水(美國(guó)Millipore純水系統(tǒng))。

2 方法與結(jié)果

2.1 根皮苷對(duì)照品溶液的制備 取根皮苷對(duì)照品5.49 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇充分溶解并定容。搖勻后精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得濃度為54.9 μg·mL-1根皮苷對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸(30：70)；流速 1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，柱度為室溫。按照以上色譜條件，取根皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣，測(cè)得根皮苷峰的保留時(shí)間為4.3 min(理論塔板數(shù)按根皮苷峰計(jì)不低于1×104，對(duì)稱因子為0.96)，其雜質(zhì)對(duì)主峰測(cè)定無干擾。色譜圖見圖1。

1.根皮苷

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取根皮苷對(duì)照品溶液(54.9 μg·mL-1)1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μL分別進(jìn)樣，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以根皮苷對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=2 152.9X+7.26(r=0.999 9)，可見根皮苷在0.054 9～1.098 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度根皮苷對(duì)照品溶液測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次。RSD =0.15%，表明儀器精密度較好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取適量根皮苷對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成6份同一濃度的對(duì)照品溶液，上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)并計(jì)算峰面積。RSD=0.37%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一根皮苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別在0，1，4，8，12，24 h進(jìn)樣檢測(cè)。根皮苷峰面積的 RSD =0.35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 根皮苷的溶解性實(shí)驗(yàn)

2.7.1 根皮苷在不同溶劑中的平衡溶解度 取過量根皮苷對(duì)照品，配制以下11種溶劑的根皮苷溶液，溶劑分別為水、無水甲醇、無水乙醇、石油醚、乙醚、丙二醇、正辛醇、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷及丙酮，超聲至不再溶解，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中(保持100 r·min-1)振搖24 h，待溶液充分平衡后取出，即得根皮苷飽和溶液。10 000 r·min-1離心10 min，取上清液得供試品溶液，用RP-HPLC法測(cè)定根皮苷在以上各溶液中的溶解度[6]。實(shí)驗(yàn)平行3 次，結(jié)果見表1。

2.7.2 根皮苷在不同pH緩沖溶液中的平衡溶解度 配制磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)，用氫氧化鈉和磷酸調(diào)節(jié)一系列pH 為2.0，4.4，5.6，6.6，7.4，8.8，10.3和11.2的磷酸鹽緩沖液，再分別制備各緩沖液的根皮苷過飽和溶液，經(jīng)快速混合器中震蕩0.5 h，靜置0.5 h，重復(fù)操作3次后，14 000 r·min-1離心10 min，各吸取上清飽和液，稀釋后進(jìn)樣，根皮苷在pH為2.0，4.0，5.6，6.6，7.4，8.8，10.3，11.2溶液中的溶解度分別為2.054，1.208，1.294，1.691，2.771，20.955，24.307，32.077 mg·mL-1(圖2)。

表1 不同溶劑中的溶解度(25 ℃)

Tab.1 Solubility in different solvents (25 ℃)

mg·mL-1

圖2 根皮苷在25 ℃不同pH值緩沖溶液中的平衡溶解度

Fig.2 Equilibrium solubility of phloridzin in different buffer solution at 25 ℃

2.7.3 根皮苷在正辛醇/水系統(tǒng)中的表觀分配系數(shù) 取適量根皮苷對(duì)照品溶于飽和正辛醇中，使溶液呈飽和狀態(tài)，靜置，3 000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液0.5 mL于10 mL 具塞試管中，分別加入正辛醇飽和的水及“2.7.2”項(xiàng)下一系列不同pH值磷酸鹽緩沖液各5 mL?？焖倩靹蛘鹗?.5 h ，靜置0.5 h，重復(fù)操作3次，吸取下層水相，14 000 r·min-1離心10 min，適當(dāng)稀釋后測(cè)定根皮苷濃度，并按公式Kow=(CoVo-CwVw)/CwVw計(jì)算表觀油水分配系數(shù)(Kow：根皮苷的表觀分配系數(shù)；Co：根皮苷在正辛醇相中初始濃度；Cw：分配平衡時(shí)根皮苷在水相中濃度；Vo：正辛醇相體積；Vw：水相體積)，結(jié)果見圖3。

3 討論

對(duì)根皮苷進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)有兩處，分別為220和284 nm，由于在波長(zhǎng)284 nm下基線平穩(wěn)、儀器噪音響應(yīng)較小，故選擇284 nm為根皮苷的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)比較了洗脫系統(tǒng)乙腈-水、甲醇-水[6]，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水系統(tǒng)中色譜峰峰形、分離度均較好，水相中加入0.05%磷酸后對(duì)分離效果及前沿現(xiàn)象有很大改善，得到的色譜峰峰形對(duì)稱，分離效果最佳，故確定乙腈-0.05磷酸溶液為流動(dòng)相。

圖3 根皮苷在正辛醇/水緩沖液系統(tǒng)中的表觀分配系數(shù)

Fig.3 Apparent partition coefficients of phloridzin inn-octyl alcohol/water buffer

目前未見測(cè)定根皮苷溶解度及油水分配系數(shù)的報(bào)道，筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用RP-HPLC法測(cè)定根皮苷的平衡溶解度。實(shí)驗(yàn)表明，根皮苷幾乎不溶于石油醚，極微溶于三氯甲烷和乙醚，微溶于水，在甲醇中的平衡溶解度較高，在pH為11.2時(shí)溶解度最大?？梢姼ぼ諡橹y溶化合物。推測(cè)是由于根皮苷結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，根據(jù)相似相溶原理，易溶于醇類。

藥物需具備適宜的水溶性和脂溶性，以便透過生物膜脂質(zhì)雙分子層被人體吸收。正辛醇-水分配系數(shù)和正辛醇-緩沖溶液分配系數(shù)在預(yù)測(cè)藥物吸收及定量結(jié)構(gòu)上具有重要意義[7]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定根皮苷的表觀油水分配系數(shù)，以期為藥物成分構(gòu)效關(guān)系、吸收代謝研究提供參考。

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Determination the Equilibrium Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficient of Phloridzin by RP-HPLC

QI Zhihua1, GUO Shuyun1,TANG Xiuling1, LI Xiaoye2, WANG Qingwei1

(1.DepartmentofPharmacy,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;2.DepartmentofMedicinalChemistry,SchoolofPharmacy,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032，China)

Objective To establish a reversed-phase high performance liquid chromatograph (RP-HPLC ) method for determination of equilibrium solubility and oil/water partition coeficient of phloridzin in different solvents. Methods A PR-HPLC method was established to detect the concentration of phloridzin in water and different organic solvents.The partition coefficients in then-octanol-water/buffer solution systems of phloridzin were determined by shaking flask method.The Inertsil ODS-3 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column was used and the detection wavelength was 284 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1, and acetonitrile- 0.05% phosphoric acid(30：70)was used as mobile phase. Results The equilibrium solubility of phloridzin was 2.07 mg·mL-1in water and 838.63 mg·mL-1in methanol at 25 ℃.A good linear relationship of phloridzin was obtained within the range of 0.054 9-1.098 μg.The regression equation wasY=2 152.9X+7.26 (r=0.999 9).The solubility values of phloridzin were higher in ethanol and propylene glycol than in other solvents. Conclusion RP-HPLC method is simple, quick and accurate for the determination of phloridzin.Phloridzin was almost insoluble in petroleum ether and poorly soluble in water.The equilibrium solubility is higher in methanol than in other solvents.The apparent distribution coefficient of phloridzin varies significantly with pH under the alkaline conditions but less in the acidic solution.

Phloridzin；Equilibrium solubility ；Apparent oil/water partition coefficient

2014-03-25

2014-05-01

*“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2011ZX09401-308-23)

戚志華(1980-)，女，陜西寶雞人，主管藥師，碩士，主要從事生藥學(xué)及新藥研發(fā)。電話：029-84777648，E-mail：qzhlily@aliyun.com。

王慶偉(1969-)，男，陜西乾縣人，副主任藥師，博士，主要從事藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。電話：029-84777716，E-mail：wqwlxy@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)10-1329-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.018