魏昕，楊舉倫

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校病理教研室，遵義 563000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科，昆明 650000)

·藥物與臨床·

ERCC1和Ki67表達與乳腺癌患者含鉑類化療方案敏感性的關(guān)系

魏昕1，楊舉倫2

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校病理教研室，遵義 563000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科，昆明 650000)

目的 探討核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)和Ki67的表達與乳腺癌患者含鉑類化學(xué)治療(化療)方案敏感性的關(guān)系。方法 經(jīng)病理學(xué)確診乳腺癌患者129例，均行紫杉醇和卡鉑聯(lián)合化療方案。吉西他濱1 000 mg·(m2)-1，靜脈滴注30 min，第1，8天；順鉑25 mg·(m2)-1，靜脈滴注，第1～3天；21 d為1個周期，化療6個周期。采用免疫組化分析患者腫瘤組織中ERCC1和Ki67的表達，并比較ERCC1和Ki67不同表達水平的患者對鉑類化療方案的敏感性和對鉑類方案化療患者生存的影響。結(jié)果 129例患者中，ERCC1-Ki67-患者18例，臨床有效率88.89%，3年累積生存率83.33%；ERCC1+Ki67-患者24例，臨床有效率50.00%，3年累積生存率62.50%；ERCC1-Ki67+患者33例，臨床有效率54.55%，3年累積生存率60.60%；ERCC1+Ki67+54例，臨床有效率22.78%，3年累積生存率31.48%。與ERCC1-Ki67-組比較，ERCC1+Ki67-組、ERCC1-Ki67+組和ERCC1+Ki67+組患者對順鉑為基礎(chǔ)的化療方案的臨床有效率明顯下降(P<0.05)。ERCC1+Ki67+組較ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組也顯著下降(P<0.05)。與ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組比較，ERCC1+Ki67+組患者3年累積生存率明顯下降(P<0.05)，而ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組患者3年累積生存率明顯低于ERCC1-Ki67-組(P<0.05)。結(jié)論 ERCC1和Ki67在乳腺癌組織中表達水平較高，與患者鉑類化療藥物的臨床有效率密切相關(guān)。

化學(xué)治療藥物；癌，乳腺；切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)；Ki67；化學(xué)治療敏感性

乳腺癌是臨床常見的腫瘤，也是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一[1]。化學(xué)治療(化療)仍然是治療乳腺癌的主要手段之一，但是在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，部分患者對化療藥物不敏感，嚴重影響臨床治療效果[2-3]。化療耐藥相關(guān)的基因是目前關(guān)注的焦點和熱點。其中核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1(Excision repair cross complementation group 1，ERCC1)是核苷酸修復(fù)過程中關(guān)鍵的基因，其在維持核苷酸修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是其過表達能使化療藥物損傷的脫氧核糖核苷酸迅速修復(fù)，進而達不到抑制腫瘤細胞生長的作用[4-5]。Ki67是一種細胞基質(zhì)內(nèi)抗原，其可直接反映腫瘤細胞的增殖狀況[6-7]。目前研究顯示，ERCC1和Ki67與鼻咽癌、非小細胞肺癌、卵巢癌以及結(jié)直腸癌的化療耐藥性有關(guān)[8-10]。關(guān)于兩者基因在乳腺癌組織中的表達情況以及與患者鉑類藥物的化療敏感性、生存率之間的關(guān)系，筆者尚未見報道。本研究以ERCC1和Ki67蛋白的表達情況進行正交分組，探討不同表達水平蛋白對患者化療耐藥和生存的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2008年6月—2012年6月收治的初治三陰性乳腺癌患者129例為研究對象。所有患者均經(jīng)體格檢查、B超、CT、MRI和局部病理學(xué)檢查確診，并且滿足下述條件：①所有患者均為初治，且雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和HER-2均為陰性；②就診時患者預(yù)期生存時間均>4個月；③Karnofsky評分(KPS)>60分；④患者就診時未見轉(zhuǎn)移病灶；⑤患者實驗室指標(biāo)正常，能夠耐受化療。129例患者年齡30～70歲，平均(58.8±9.8)歲；未婚19例，已婚110例；根據(jù)AJCC乳腺癌cTNM分期：Ⅱ期101例，Ⅲ期28例。病理分型：小葉癌58例，導(dǎo)管癌51例，其他類型20例；組織學(xué)分級(Elston and Ellis分級法)：Ⅰ級19例，Ⅱ級63例，Ⅲ級47例。

1.2 化療方案 所有患者術(shù)后均行紫杉醇和卡鉑聯(lián)合化療方案。吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030104)1 000 mg·(m2)-1，靜脈滴注30 min，第1，8天；順鉑(揚子江藥業(yè)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20053001)25 mg·(m2)-1，靜脈滴注，第1～3天；21 d為一個周期，化療6個周期。患者在治療期間給予常規(guī)托烷司瓊止吐。

1.3 實驗材料 腫瘤標(biāo)本來自于手術(shù)切除腫瘤組織。ERCC1和Ki67鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司，羊抗鼠二抗購自北京金橋中杉生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團。

1.4 免疫組化方法 石蠟包埋的標(biāo)本組織連續(xù)切成薄片5 μm，粘附于多聚賴氨酸處理的玻片上，然后在50 ℃烘箱中烤1 h，然后依次用二甲苯及100%，95%，80%和75%乙醇水化，純化水洗滌3次。將玻片置于含檸檬酸鈉的緩沖液中，加熱處理8 min，重復(fù)2次，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌3次；在玻片組織部位滴加3%過氧化氫(75%甲醇配制)處理30 min去除內(nèi)源性的過氧化氫酶。PBS洗滌3次，每次5 min。將稀釋的ERCC1和Ki67一抗按照比例稀釋，滴加到玻片組織上，4 ℃ 孵育過夜，次日PBS洗滌玻片3次，每次5 min；然后在玻片上滴加10%山羊血清稀釋的羊抗鼠的二抗，室溫孵育1 h后，用PBS洗滌3次，每次5 min。然后在玻片上滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液50 μL，邊染色邊在顯微鏡下觀察，染色結(jié)束后用自來水沖洗，并依次在70%，80%，90%和100%乙醇中脫水，在二甲苯中脫水干燥，并用中性樹脂固定，在顯微鏡下進行固定。

1.5 觀察指標(biāo)和評定標(biāo)準(zhǔn) 分別對患者乳腺癌組織中ERCC1和Ki67的表達水平進行分析，并根據(jù)ERCC1和Ki67的陽性或陰性分析其對吉西他濱聯(lián)合順鉑化療方案的臨床治療有效率，以及對患者生存率的影響。ERCC1和Ki67評定標(biāo)準(zhǔn)采用分級評分原則，即每張切片在400倍顯微鏡下隨機選取10個視野，計算每個視野中100個細胞中陽性細胞的比例，取其平均值作為ERCC1和Ki67陽性細胞的比例。如陽性細胞比例<10%視為陰性，陽性細胞比例>10%視為陽性[11]。臨床有效率采用世界衛(wèi)生組織制定的關(guān)于實體瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)進行評定，分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定和進展。臨床有效率(%)=(完全緩解+部分緩解)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1和Ki67表達情況分析結(jié)果 見圖1所示，ERCC1和Ki67蛋白均表達于細胞核中，呈棕色顆粒形狀。129例患者中，ERCC1陰性患者51例，陽性患者78例；Ki67陰性患者42例，陽性患者87例。根據(jù)ERCC1和Ki67蛋白表達情況，將患者分為4組：ERCC1-Ki67-雙陰性患者18例，ERCC1+Ki67-單陽性患者24例，ERCC1-Ki67+單陽性患者33例，ERCC1+Ki67+雙陽性患者54例。4組患者一般資料見表1，患者年齡、TNM分型、病理分型和組織學(xué)分級等指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 不同ERCC1和Ki67表達患者臨床治療有效率比較 見表2。與ERCC1-Ki67-比較，ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率明顯降低(P<0.05)，與ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+比較，ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率下降更顯著(P<0.05)。

2.3 不同ERCC1和Ki67表達患者生存率比較 129例患者隨訪3～60個月，沒有失訪者，平均隨訪(50.9±5.8)個月。根據(jù)隨訪過程中患者死亡情況建立生存曲線，見圖2。分析顯示ERCC1-Ki67-、ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67+組患者累積生存率分別為83.33%，62.50%，60.60%和31.48%。采用Log-Rank檢驗對4組患者累積生存率比較顯示，ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+患者累積生存率明顯高于ERCC1+Ki67+組患者(P<0.05)，但是其明顯低于ERCC1-Ki67-患者(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌化療耐藥是目前臨床面臨的主要治療問題，因此探討導(dǎo)致化療耐藥的機制是目前臨床研究的重點和熱點。近年來研究顯示，許多基因的異常表達如P-gp等可能參與乳腺癌的化療耐藥性。其中ERCC1是重要的核苷酸剪切修復(fù)家族成員之一，其主要參與DNA損傷識別和DNA鏈的切割，在DNA修復(fù)過程中具有重要作用[12-13]。LORD等[14]在非小細胞肺癌患者組織中發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA表達水平與含鉑類化療藥物存在密切關(guān)系，高表達患者的生存期明顯短于低表達患者。另一項前瞻性研究顯示ERCC1高表達的患者接受卡鉑和吉西他濱聯(lián)合治療的臨床緩解率明顯低于ERCC1低表達患者，證實ERCC1表達水平與鉑類化療藥物的敏感性相關(guān)[15]。Ki67抗原是與細胞增殖相關(guān)的核抗原，參與細胞的有絲分裂，目前研究顯示其在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用[16-17]。近年來，有學(xué)者也提出其與腫瘤化療敏感性相關(guān)。一項直腸癌研究顯示Ki67高表達的患者對放化療的敏感性明顯降低，接受化療的Ki67指數(shù)較高的患者生存期明顯低于Ki67低表達者[18]。但是這兩個蛋白在乳腺癌組織中的表達水平與鉑類化療藥物敏感性之間是否存在關(guān)系，目前報道較少[19]。因此本研究分析不同ERCC1和Ki67表達水平的患者接受鉑類化療后的臨床治療有效率和生存率的變化。

ERCC1-Ki67-患者臨床治療有效率明顯高于ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+組患者，說明ERCC1和Ki67的高水平表達可能降低患者對鉑類化療藥物的敏感性。如果這一結(jié)果成立，則ERCC1+Ki67+表達雙陽性患者臨床治療有效率則更低。本研究結(jié)果如預(yù)期，發(fā)現(xiàn)ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率遠遠低于ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67-組患者。這一結(jié)果充分說明ERCC1和Ki67的高表達與乳腺癌患者鉑類化療的臨床治療有效率呈負相關(guān)。即ERCC1和Ki67表達預(yù)告，臨床治療有效率越低，并表現(xiàn)出協(xié)同疊加效應(yīng)。

A.ERCC1陰性；B.ERCC1陽性；C.Ki67陰性；D.Ki67陽性

表1 4組患者一般資料比較 例Tab.1 Comparison of baseline data among four groups of patients

表2 4種ERCC1和Ki67表達患者臨床治療有效率比較 例Tab.2 Comparison of clinical effective rate among four groups of patients with different expression of ERCC1 and Ki67

圖2 4種ERCC1和Ki67表達水平患者5年累積生存率比較

Fig.2 Comparison of 5-year cumulative survival rate among four groups of patients with different expression of ERCC1 and Ki67

在生存率方面，由于ERCC1和Ki67的高表達直接導(dǎo)致患者對化療藥物的耐藥，因此生存時間ERCC1-Ki67-患者>ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+患者> ERCC1+Ki67+患者。

綜上所述，ERCC1和Ki67在乳腺癌組織中呈高表達，并與鉑類化療藥物的敏感性有密切關(guān)系。檢測其表達水平對于個性化選擇化療藥物具有重要意義。但是本研究病例有限，需進一步增加樣本量進行統(tǒng)計分析，增加結(jié)果的說服力。

[1] SIEGEL R，NAISHADHAM D，JEMAL A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62(1)：10-29.

[2] POTHURI B.BRCA1-and BRCA2-related mutations：thera-peutic implications in ovarian cancer[J].Ann Oncol，2013，24(Suppl 8)：22-27.

[3] 程軍，張士勇，葉云.奧沙利鉑臨床應(yīng)用評價分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(4)：515-517.

[4] MUALLEM M Z，BRAICU I，NASSIR M，et al.ERCC1 exp-ression as a predictor of resistance to platinum-based chemotherapy in primary ovarian cancer[J].Anticancer Res，2014，34(1)：393-399.

[5] 杜培，王沂峰，張曉薇，等.ERCC1和BRCA1表達與原發(fā)性上皮性卵巢癌患者臨床因素及鉑類化療敏感性的研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(6)：747-751.

[6] PATHMANATHAN N，BALLEINE R L.Ki67 and prolife-ration in breast cancer[J].J Clin Pathol，2013，66(6)：512-516.

[7] DOWSETT M，NIELSEN T O，A'HERN R，et al.Assessment of Ki67 in breast cancer：recommendations from the international Ki67 in breast cancer working group[J ].J Natl Cancer Inst，2011，103(22)：1656-1664.

[8] CIANCIO N，GALASSO M G，CAMPISI R，et al.Prognostic value of p53 and Ki67 expression in fiberoptic bronchial biopsies of patients with non small cell lung cancer[J].Multidiscip Respir Med，2012，7(1)：29.

[9] KRIKELIS D，BOBOS M，KARAYANNOPOULOU G，et al.Expression profiling of 21 biomolecules in locally advanced nasopharyngeal carcinomas of Caucasian patients[J].BMC Clin Pathol，2013，(13)：1.doi：10.1186/1472-6890-13-1.

[10] ZAJCHOWSKI D A，KARLAN B Y，SHAWVER L K.Treat-ment-related protein biomarker expression differs between primary and recurrent ovarian carcinomas[J].Mol Cancer Ther，2012，11(2)：492-502.

[11] 單利，韓志剛，劉莉，等.晚期非小細胞肺癌ERCCl和BRCAl的表達及與順鉑耐藥性的臨床研究[J].腫瘤，2009，29(6)：571-574.

[12] CHEN X，WU J，LU H，et al.Measuring β-tubulin Ⅲ，Bcl-2，and ERCC1 improves pathological complete remission predictive accuracy in breast cancer[J].Cancer Sci，2012，103(2)：262-268.

[13] FU J M，ZHOU J，SHI J，et al.Emodin affects ERCC1 exp-ression in breast cancer cells[J].J Transl Med，2012，10 (Suppl 1)：7.

[14] LORD R V，BRABENDER J，GANDARA D，et al.Low ER-CC1 expression correlates with prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8(7)：2286-2291.

[15] HANDRA-LUCA A，HERNANDEZ J，MOUNTZIOS G，et al.Excision repair cross complementation group 1 immunohistochemical expression predicts objective response and cancer-specific survival in patients treated by cisplatin-based induction chemotherapy for locally advanced head and neck squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2007，13(13)：3855-3859.

[16] KONTZOGLOU K，PALLA V，KARAOLANIS G，et al.Cor-relation between Ki67 and breast cancer prognosis[J].Oncology.2013，84(4)：219-225.

[17] YERUSHALMI R，WOODS R，RAVDIN P M，et al.Ki67 in breast cancer：prognostic and predictive potential[J].Lancet Oncol，2010，11(2)：174-183.

[18] SUROWIAK P，MATERNA V，KAPLENKO I，et al.Topoi-somerase 1A，HER/2neu and Ki67 expression in paired primary and relapse ovarian cancer tissue samples[J].Histol Histopathol，2006，21(7)：713-720.

[19] KIM N K，PARK J K，LEE K Y，et al.p53，BCL-2，and Ki-67 expression according to tumor response after concurrent chemoradiotherapy for advanced rectal cancer[J].Ann Surg Oncol，2001，8(5)：418-424.

ERCC1 and Ki67 Expression in Patients with Breast Cancer and Relationship Between Its Expression and Sensitivity of Platinum Chemotherapy

WEI Xin1, YANG Julun2

(1.DepartmentofPathology,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563000,China；2.DepartmentofPathology,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Kunming650000,China)

Objective To investigate the expressions of excision repair cross complementation group 1 (ERCC1) and Ki67 in patients with breast cancer, and the relationships between their expressions and sensitivity of platinum-based chemotherapy. Methods Totally, 129 cases were pathologically diagnosed as breast cancer.Paclitaxel and carboplatin were used simultaneously.Chemotherapy regimen was as follows: Gemcitabine 1 000 mg·(m2)-1, IV drop on day 1 and 8；cisplatin 25 mg·(m2)-1, IV drop on day 1-3, for six cycles (21 days a cycle).ERCC1 and Ki67 expression in tumor tissue was observed by immunohistochemical analysis.Platinum-based chemotherapy sensitivity and survival of patients with different levels of ERCC1 and Ki67 expression were analyzed. Results In 129 patients, 18 cases were ERCC1 and Ki67 double-negative (ERCC1-Ki67-), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 88.89% and 83.33%, respectively.Twenty-four cases were ERCC1 positive but Ki67 negative (ERCC1+Ki67-), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 50.00% and 62.50%, respectively.Thirty-three cases were ERCC1 negative but Ki67 positive (ERCC1-Ki67+), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 54.55% and 60.60%, respectively.Fifty-four patients were ERCC1 and Ki67 double-positive (ERCC1+Ki67+), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 22.78% and 31.48%, respectively.Compared with ERCC1-Ki67-group, the clinical treatment efficiencies of cisplatin-based chemotherapy in ERCC1+Ki67-group, ERCC1-Ki67+group, and ERCC1+Ki67+group were significantly decreased (P<0.05).The clinical treatment efficiency in patients of ERCC1+Ki67+group with cisplatin-based chemotherapy was significantly decreased as compared with ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group (P<0.05).Compared with ERCC1-Ki67-group, three-year cumulative survival rate in patients of ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group, ERCC1+Ki67+group was significantly decreased (P<0.05).Compared with ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group, three-year cumulative survival rate in patients of the ERCC1+Ki67+group was significantly decreased (P<0.05). Conclusion The expression levels of ERCC1 and Ki67 in breast cancer were high.Their expression levels are closely related with clinical efficiency of platinum-based chemotherapy.

Chemotherapy drugs；Cancer, breast；Excision repair cross complementation group 1；Ki67；Chemosensitivity

2014-09-29

2014-12-20

魏昕(1975-)，女，貴州遵義人，副教授，學(xué)士，研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)、乳腺癌。電話：(0)18877339318，E-mail：gfdxj8641@163.com。

R979.1；R737.9

B

1004-0781(2015)10-1314-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.014