李東

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，徐州 221006)

葎草顆粒對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的作用

李東

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，徐州 221006)

目的 探討葎草顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性支氣管炎小鼠的作用及其作用機(jī)制。方法 將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，右美沙芬組或氯化銨組，葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組(分別灌胃葎草顆粒溶液3.00，1.50，0.75 g·kg-1)，觀察葎草顆粒對(duì)濃氨水致咳小鼠影響和對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響。采用香煙加甲醛熏法復(fù)制慢性支氣管炎小鼠模型，將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為6組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，桂龍咳喘寧膠囊組，葎草顆粒高劑量、中劑量、低劑量組，每組10只。從造模第18天起，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組小鼠灌胃葎草顆粒，劑量分別為3.00，1.50，0.75 g·kg-1；桂龍咳喘寧膠囊組小鼠灌胃桂龍咳喘寧膠囊內(nèi)容物，劑量為600 mg·kg-1，每天1次，共15 d。觀察各組小鼠肺組織白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果 通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察發(fā)現(xiàn)，葎草顆粒能明顯減輕小鼠慢性支氣管炎的損傷程度；正常對(duì)照組、葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組2 min內(nèi)分別咳嗽(17.50±5.38)，(11.90±4.46)，(12.60±3.47)，(9.50±3.24)次；酚紅分泌量分別為(0.52±0.11)，(0.65±0.15)，(0.64±0.14)，(0.67±0.19)μg·mL-1；葎草顆粒能明顯減少氨水導(dǎo)致的小鼠咳嗽次數(shù)，增加小鼠氣管酚紅排泄量。正常對(duì)照組，模型對(duì)照組及葎草顆粒大劑量組肺組織TNF-α的含量分別為(25.8±6.9)，(66.3±11.7)，(43.5±7.7) ng·mg-1，肺組織IL-8的含量分別為(27.1±9.1)，(48.2±11.4)，(36.5±8.2) ng·mg-1。模型對(duì)照組TNF-α、IL-8含量均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，高劑量葎草顆?？擅黠@降低肺組織中TNF-α和IL-8的含量(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論 葎草顆粒對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠病理?yè)p傷有明顯改善作用，并具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用，其作用機(jī)制可能與降低TNF-α、IL-8含量有關(guān)。

葎草顆粒；支氣管炎，慢性；腫瘤壞死因子；白細(xì)胞介素

慢性支氣管炎是危害健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，咳、痰是呼吸系統(tǒng)疾病主要癥狀，炎癥和變態(tài)反應(yīng)是疾病的起因[1]。葎草顆粒由葎草、夏枯草、百部、白及等中藥組成，具有清肺止咳的功效。筆者對(duì)葎草顆粒的鎮(zhèn)

咳、祛痰藥理作用進(jìn)行研究，并采用香煙加甲醛熏法制作慢性支氣管炎小鼠模型，通過(guò)觀察葎草顆粒對(duì)慢性支氣管炎小鼠肺組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-8含量的影響，以闡明其治療慢性支氣管炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2010-0003，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(蘇)20032003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2014-0011。飼養(yǎng)環(huán)境20～25 ℃，相對(duì)適度60%～70%，保持安靜清潔，通風(fēng)通氣。

1.2 藥品與試劑 葎草顆粒(由徐州生物工程學(xué)院制劑室制備)；IL-8、TNF-α免疫試劑盒購(gòu)自北京北免東雅生物技術(shù)研究所，批號(hào)：120925。氫溴酸右美沙芬膠囊(唐山容大藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120902)；氯化銨，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：100223；桂龍咳喘寧膠囊[桂龍藥業(yè)(安徽)有限公司，批號(hào)：121016]；氨水(沈陽(yáng)天罡化學(xué)試劑廠，批號(hào)：110811)；酚紅(上海撫生生物科技有限公司，批號(hào)：130506)。

1.3 主要儀器 高速離心機(jī)(上海分析儀器)；可控式恒溫水浴鍋(上海錦屏儀器儀表有限公司)；DIAX900內(nèi)切式組織勻漿機(jī)(Heidolph公司)；SN-682型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(上海核輻射光電儀器廠)；Leica切片機(jī)(上海五相儀器儀表有限公司)。

1.4 對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響 參照文獻(xiàn)[2]。取小鼠50只，雌雄各半，稱定質(zhì)量、編號(hào)后，數(shù)字隨機(jī)法分為5組，即正常對(duì)照組、右美沙芬組及葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組，每組10只。葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組分別灌胃葎草顆粒溶液3.00，1.50，0.75 g·kg-1，右美沙芬組給予右美沙芬0.015 g·kg-1，正常對(duì)照組給予等容積0.9%氯化鈉溶液，每只小鼠給藥間隔約4 min，連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥后1 h，將小鼠扣入500 mL燒杯中，再將注入濃氨水0.2 mL的棉球迅速放入燒杯中，上面加蓋篩網(wǎng)，以小鼠腹肌強(qiáng)烈收縮，并且張大嘴為咳嗽動(dòng)作指標(biāo)，記錄小鼠的咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)及3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5 對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響 參照文獻(xiàn)[2]。將小鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、氯化銨組及葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組，每組10只。每天灌胃給藥一次，連續(xù)7 d，葎草顆粒大劑量、中劑量、低劑量組分別灌胃葎草顆粒溶液3.00，1.50，0.75 g·kg-1，氯化銨組前6 d灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天給予氯化銨，末次給藥后30 min，腹腔注射5%酚紅溶液500 mg·kg-1，30 min后處死小鼠，取自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入盛有5%碳酸氫鈉溶液3 mL中，充分振蕩，使氣管段中的酚紅完全釋放，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)吸光度(A)值，用酚紅作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算酚紅含量。

1.6 對(duì)小鼠慢性支氣管炎的影響 將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為6組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，桂龍咳喘寧膠囊組，葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組，每組10只。小鼠慢性支氣管炎模型的復(fù)制，參照文獻(xiàn)[3]造模方法并加以改進(jìn)，建立煙熏聯(lián)合甲醛刺激致小鼠慢性支氣管炎模型。將除正常對(duì)照組外5組小鼠放置于自制的玻璃煙室內(nèi)，在煙室上方用3條細(xì)線懸掛直徑為10 cm的圓形濾紙，在濾紙上噴入甲醛，刺激10 min后取出，間隔10 min后，煙熏10 min，每次5支香煙。煙熏聯(lián)合甲醛刺激共25 d，其中前7 d，每次甲醛量為220 μL，從第8天開(kāi)始每次甲醛量增至1 000 μL，后7 d停用甲醛。從造模第18天起，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組小鼠灌胃葎草顆粒，劑量分別為3.00，1.50，0.75 g·kg-1(分別相當(dāng)于人劑量的14.20，7.10，3.55倍)；桂龍咳喘寧膠囊組小鼠灌胃桂龍咳喘寧膠囊，劑量為600 mg·kg-1，每天1次，共15 d。給藥結(jié)束后24 h，取小鼠左側(cè)肺臟中部組織0.4 cm×0.4 cm，用10%甲醛溶液固定，組織切片用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡觀察肺與支氣管的組織形態(tài)變化；同時(shí)稱取濕質(zhì)量約0.2 g右肺中部組織，用組織勻漿機(jī)制備10%肺組織勻漿，采用放射免疫法檢測(cè)肺組織勻漿中IL-8、TNF-α的含量，各項(xiàng)檢測(cè)均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組小鼠支氣管、細(xì)支氣管形態(tài)基本正常，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)增厚、變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。模型對(duì)照組小鼠肺組織病理切片顯示，大片狀肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)出血較多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡萎陷，小鼠支氣管管壁形態(tài)發(fā)生改變，黏膜結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)纖毛粘連、倒伏、脫失等病理變化，支氣管管腔出現(xiàn)漿液滲出、黏膜層出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)慢性支氣管炎的病理改變，模型復(fù)制成功。葎草顆粒大劑量、中劑量、小劑量組及桂龍咳喘寧膠囊組小鼠支氣管纖毛上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落等病理變化均比模型對(duì)照組輕；支氣管管腔未見(jiàn)漿液滲出。見(jiàn)圖1。

2.2 葎草顆粒對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響 結(jié)果見(jiàn)表1，與正常對(duì)照組比較，右美沙芬組小鼠2和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.05)；葎草顆粒能明顯減少小鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，葎草顆粒大劑量組、小劑量組小鼠3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01)。

2.3 葎草顆粒對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，葎草顆粒各劑量組小鼠氣管內(nèi)酚紅分泌量明顯增加(P<0.05)。

2.4 葎草顆粒對(duì)慢支小鼠肺組織中TNF-α和IL-8含量的影響 結(jié)果見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TNF-α、IL-8含量明顯增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，葎草顆粒大劑量組肺組織中TNF-α(P<0.01)和IL-8(P<0.05)含量明顯降低。

3 討論

慢性支氣管炎是常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著年齡增長(zhǎng)，患病率遞增，現(xiàn)今公認(rèn)吸煙為慢性支氣管炎最主要的發(fā)病因素。本實(shí)驗(yàn)采用煙熏聯(lián)合甲醛刺激法復(fù)制小鼠慢性支氣管炎模型，光鏡下可見(jiàn)模型對(duì)照組小鼠病理切片支氣管黏膜上皮壞死脫落，間質(zhì)充血水腫，慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其組織病理學(xué)改變與文獻(xiàn)[4]報(bào)道相近，表明慢性支氣管炎模型復(fù)制成功。葎草顆粒各劑量組小鼠支氣管炎癥較輕，細(xì)支氣管部分上皮脫落缺失，肺泡腔充氣良好，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明葎草顆?？筛纳坡灾夤苎啄Ｐ托∈笾夤苎椎牟±碜兓?，具有緩解支氣管炎癥的作用。

慢性支氣管炎在中醫(yī)學(xué)屬于“咳嗽”“痰證”等范疇，咳證病位主要在肺系，故前人有“咳證雖多，無(wú)非肺病”的說(shuō)法[5]。慢性支氣管炎臨床可出現(xiàn)每年持續(xù)3個(gè)月以上的咳嗽、咯痰等癥狀。急性發(fā)作期在抗感染治療的同時(shí)，應(yīng)用祛痰、鎮(zhèn)咳藥，以改善癥狀[6]。氨水引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葎草顆粒能明顯減少小鼠咳嗽次數(shù)，酚紅排泄實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葎草顆粒能增加小鼠氣管酚紅排泄量，由此可見(jiàn)葎草顆粒具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。

TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，活化的中性粒細(xì)胞也可合成。TNF-α可參與全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙的發(fā)生[7]。在高濃度時(shí)，會(huì)引起局部免疫反應(yīng)器官甚至系統(tǒng)的損害[8]。研究表明，TNF-α可促進(jìn)肺損傷早期肺泡巨噬細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡反過(guò)來(lái)促進(jìn)急性肺損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)，可反映機(jī)體炎性損傷的程度[9-12]。IL-8 對(duì)中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞具有趨化作用，并可激活中性粒細(xì)胞，造成多種炎性遞質(zhì)的釋放，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠肺組織中TNF-α和IL-8含量均較正常對(duì)照組明顯升高；葎草顆粒各劑量組小鼠肺組織中TNF-α和IL-8含量均明顯降低，提示葎草顆粒通過(guò)降低TNF-α和IL-8含量，進(jìn)而抑制慢性支氣管炎的發(fā)展。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.桂龍咳喘寧膠囊組；D.葎草顆粒小劑量組；E.葎草顆粒中劑量組；F.葎草顆粒大劑量組

圖1 6組小鼠肺組織病理圖片(HE，×100)

A.normal control group；B.model control group；C.Guilongkechuanningcapsule group；D.low-dose HSP group；E.medium-dose HSP group；F.high-dose HSP group

Fig.1 Pneumal histopathology of six groups of mice(HE，×100)

表1 葎草顆粒對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01Compared with normal control group， *1P<0.05，*2P<0.01

表2 5組小鼠氣管酚紅排泌量的比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.05Compared with normal control group， *1P<0.05

表3 6組小鼠肺組織中TNF-α、IL-8含量測(cè)定值

與模型對(duì)照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05Compared with model control group， *1P<0.01，*2P<0.05

綜上所述，葎草顆粒對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠病理?yè)p傷有明顯的修復(fù)作用，并且具有鎮(zhèn)咳、祛痰作用。葎草顆粒防治慢性支氣管炎的作用機(jī)制可能與減輕氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Effect of Humulus Scandens Particles on Chronic Bronchitis Models of Mice

LI Dong

(XuzhouVocationalCollegeofBioengineering,Xuzhou221006,China)

Objective To study the effects and the therapeutic mechanism ofHumulusscandensparticles (HSP) on the mice with chronic bronchitis(CB). Methods Mice were divided into normal control group, dextromethorphan group or ammonium chloride group, the high-, middle- and low-dose of HSP groups (These three groups received gavage administration of HSP at 3.00 g·kg-1, 1.50 g·kg-1and 0.75 g·kg-1,respectively) randomly.The effects of HSP on ammonia-induced cough and trachea phenol red excretion in mice were observed.CB mouse model was established by inhaling smoke and formaldehyde.In total, 60 mice were divided into 6 groups by the method of random digits table: normal control group, model control group,Guilongkechuanningcapsulegroup, the high-, middle- and low-dose HSP groups (n=10 each group).After modeling for 18 days, mice in normal control group and model control group were administered intragastrically with 0.9% sodium chloride solution.Mice in the high-, middle- and low-dose HSP groups were daily treated with HSP at 3.00, 1.50 and 0.75 g·kg-1,respectively, by intragastric administration.Mice inGuilongkechuanningCapsule group were administered withGuilongkechuanningCapsule (600 mg·kg-1), once a day, for 15 days.The tumor necrosis factor alpha (TNF-α) & interleukin-8 (IL-8) contents in lung tissues of each group were determined. Results By hematoxylin-eosin (HE) staining, it was found that HSP alleviated the damage of CB in mice.The frequency of cough in 2 min in the normal control group, the high-, middle- and low-dose HSP groups were (17.50±5.38), (11.90±4.46), (12.60±3.47), (9.50±3.24), respectively, and the ecretion of phenol red were (0.52±0.11), (0.65±0.15), (0.64±0.14), (0.67±0.19) μg·mL-1, respectively.The content of TNF-α in lung tissues of the normal control group, model control group,the high dose HSP group was (25.8±6.9), (66.3±11.7), (43.5±7.7) ng·mg-1, respectively.The content of IL-8 in lung tissues of the normal control group, model control group, the high-dose HSP group were (27.1±9.1), (48.2±11.4) and (36.5±8.2) ng·mg-1, respectively.The contents of TNF-α and IL-8 in lung tissues of the model control group were significantly higher than those in normal control group (bothP<0.01).Compared with the model control group, high-dose HSP could obviously decrease the contents of TNF-α and IL-8 in lung tissues (P<0.01 orP<0.05). Conclusion HSP can obviously alleviate the pathomorphological changes in mice with CB and has antitussive and expectorant effecs.The therapeutic mechanism of HSP for CB may be related to decreasing the contents of TNF-α and IL-8 in lung tissue.

Humulusscandensparticles；Bronchitis, chronic；Tumor necrosis factor；Interleukin

2014-08-05

2014-10-06

李東(1979-)，男，河北徐水人，講師，碩士，研究方向：中藥新藥研發(fā)。電話：0516-3628047，E-mail：lidong3379@aliyun.com。

R286；R285.5

A

1004-0781(2015)10-1284-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.005