楊振泉，周海波，高 璐，饒勝其，尹永祺，方維明

（揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127）

超聲波協(xié)同流水凈化對克氏原螯蝦中菌落總數(shù)及菌相構(gòu)成的影響

楊振泉，周海波，高 璐，饒勝其，尹永祺，方維明

（揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127）

目的：研究超聲波協(xié)同流水凈化對活體克氏原螯蝦攜帶的細菌數(shù)量及菌相構(gòu)成的影響。方法：測定了凈化過程中克氏原螯蝦殼+肉、腮部和腸道部位菌落總數(shù)變化，并應(yīng)用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）指紋圖譜結(jié)合16S rDNA測序鑒定分析龍蝦在凈化處理前后不同部位的菌相構(gòu)成。結(jié)果：超聲波協(xié)同流水處理能夠顯著減少蝦殼+肉、腮和腸道部位的細菌載量，降低量分別達到2.18、2.23、1.01（lg（CFU/g））。挑取的218個單菌落中存在21種不同的RAPD譜型，不同譜型的細菌屬于9個屬18個種，其中氣單胞菌屬、黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬和腸桿菌屬細菌為蝦殼肉和腮中的優(yōu)勢菌群，凈化處理后蝦中分布的細菌種群數(shù)降低為6個屬9個種，其中溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、黃桿菌（Flavobacterium granuli）和腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是殘留的優(yōu)勢細菌種群。結(jié)論：超聲波協(xié)同流水凈化對活體克氏原螯蝦具有良好的減菌效果。

克氏原螯蝦；凈化；超聲波；菌群

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，味道鮮美、風(fēng)殊獨特，是一種低脂肪、高蛋白的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)食品，深受廣大消費者歡迎?？耸显r原產(chǎn)于北美洲，是我國目前養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦種類。近年來，江浙滬地區(qū)大中城市的年小龍蝦消費量都在萬噸以上，僅江蘇地區(qū)小龍蝦產(chǎn)品（蝦仁和整肢龍蝦）出口量達5 500 t[1]。由于小龍蝦生長環(huán)境復(fù)雜但適應(yīng)性強，其體內(nèi)外會攜帶大量的微生物[2]，其中包括一些重要的人獸共患病原如致病性嗜水氣單胞菌[3]、副溶血性弧菌[4]、致病性螺旋體[5]等，若控制不當(dāng)，食用后會對人體健康產(chǎn)生危害并造成貿(mào)易障礙[6-7]。流水凈化系統(tǒng)是國外常見的蝦類凈化體系[8-9]，原料蝦經(jīng)過系統(tǒng)凈化1～2 d可以清除小龍蝦腸道消化食物，改善外觀，增加市場價值，并能夠降低去殼蝦仁的細菌數(shù)量[9]。但我國目前小龍蝦清洗凈化體系尚未形成工業(yè)化規(guī)模，清洗操作簡單，相關(guān)研究也很少，給小龍蝦及其產(chǎn)品的安全性和品質(zhì)帶來隱患。隨著我國小龍蝦養(yǎng)殖和加工產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展以及為保證消費者的食用安全，開展相關(guān)研究非常必要。近年來研究表明，超聲波在液體中的空化效應(yīng)導(dǎo)致液體中產(chǎn)生瞬間高溫、高壓及其交變能夠在極短的時間內(nèi)殺滅和破壞多種微生物[10]，利用超聲波協(xié)同其他殺菌技術(shù)如熱處理、紫外線、化學(xué)殺菌劑量在食品加工和水處理中顯示廣闊的應(yīng)用前景[11-12]。但超聲波協(xié)同流水凈化系統(tǒng)是否能夠?qū)崿F(xiàn)活體小龍蝦中微生物有效減除目前國內(nèi)外尚沒有相關(guān)研究報道。本實驗對克氏原螯蝦在超聲波協(xié)同流水凈化處理過程中殼肉、腮部和腸道部位的菌落總數(shù)變化進行了研究，并應(yīng)用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）指紋圖譜結(jié)合16S rDNA測序鑒定對菌相構(gòu)成及變化進行了分析，旨在為原料克氏原螯蝦的減菌化處理和高效清洗和凈化體系建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料、培養(yǎng)基與試劑

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）樣品來源于揚州本地的生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，平均質(zhì)量為（39.5±1.5）g/只。

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱生物試劑有限公司；蛋白酶K、10×Buffer、dNTPs、Taq酶、DNA Marker、細菌16S rDNA擴增引物（8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和15R：5’-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3’）、隨機引物（AP31：5’-AGGGGTCTTG-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；KQ5200超聲波洗滌器 昆山市超聲儀器有限公司；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機 金壇市榮華儀器制造公司；UV-2401PC紫外分光光度計 日本島津公司；TG16-WS型臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tommy公司；DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炗邢薰荆籄BI2720熱循環(huán)儀 美國Life Technologies公司；DYYSB型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 法國Vilber Lourmat公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集

從捕撈不超過2 h的克氏原螯蝦中，挑選色澤均一、體格健碩、活力強的個體，加冰塊保藏并運送到實驗室后立即實驗。

1.3.2凈化處理

隨機選取10只克氏原螯蝦測定起始帶菌量，其余蝦隨機分成3組，每組30只放入3只容量10 L的超聲波洗滌器（40 kHz，160 W），將凈水器過濾的自來水接入洗滌池，調(diào)節(jié)水流量為45 L/h，凈化時間為12 h。處理組1不加超聲波處理；處理組2在2 h超聲處理1次，持續(xù)時間120 s；處理組3在2、6 h超聲處理2次，持續(xù)時間均為120 s，凈化過程中每隔4 h取樣1次，每次10只用于菌落總數(shù)測定。

1.3.3菌落總數(shù)測定

將克氏原螯蝦頭尾分開，無菌條件下分別取腮部，腸道以及尾部的殼與肉部分，將取下的三部分樣品分別稱質(zhì)量后參考文獻[13]的方法與滅菌生理鹽水按1∶10（m/V）的比例混合并勻漿，無菌吸取勻漿1 mL用滅菌生理鹽水做10倍遞增稀釋。選擇5個連續(xù)稀釋度，每個稀釋度取250 ?L涂布營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，每個稀釋度涂布2個培養(yǎng)皿，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，人工計數(shù)并計算菌落總數(shù)（CFU/g），實驗重復(fù)3次，取平均值表示樣品中的菌落總數(shù)。

1.3.4細菌分離

每個樣品選擇3個分離良好（菌落數(shù)在100～300 CFU/g之間，菌落無黏連）的菌落計數(shù)平板挑取單菌落，每個平板隨機挑取總菌落數(shù)的10%～15%，挑取的單菌落在營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線純化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物進行標(biāo)號后加15%甘油于-70℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5細菌基因組DNA的提取

細菌基因組DNA的提取方法參照文獻[14]所述的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取。

1.3.6 RAPD指紋圖譜擴增

菌株之間的基因型差異通過RAPD指紋圖譜鑒別。以細菌基因組DNA為模板，應(yīng)用AP31隨機引物進行RAPD擴增。將DNA提取物用ddH2O稀釋至50 ng/μL，隨機引物濃度稀釋至10 pmol/μL，優(yōu)化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為：模板2.0 ?L，dNTPs 0.5 ?L，隨機引物2.0 ?L，10×Buffer 2.5 ?L，MgCl22.5 ?L，Taq酶0.3 ?L，ddH2O 15.7 ?L；RAPD反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min；36℃退火55 s；72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃補充延伸10 min。取10 ?L產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳（電壓5 V/cm）1.5 h，EB染色20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，根據(jù)條帶清晰程度，彌散背景以及帶型強弱情況選擇穩(wěn)定的指紋圖譜進行分析。

1.3.7指紋圖譜聚類分析

根據(jù)在指紋圖譜中同一遷移率位點上的擴增條帶的“有”和“無”進行數(shù)字化處理，用“1”表示“有”，“0”表示“無”，建立矩陣，應(yīng)用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的0-1系統(tǒng)聚類分析程序，選擇Nei氏遺傳距離和類平均法進行聚類分析。

1.3.8 16S rDNA擴增及測序鑒定

以基因組DNA為模板進行16S rDNA的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50 ?L）包括：模板（50 ng/?L）2.0 ?L、dNTPs（10 mmol/L）2.0 ?L、25 pmol/?L引物8F和15R各2.0 ?L、10×Buffer 5.0 ?L、MgCl2（25 mmol/L）2.0 ?L、Taq酶（5 U/?L）0.3 ?L，最后加ddH2O補足至50 ?L。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火50 s，72℃延伸2.0 min，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。取7.0 ?L PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，其余PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）有限公司測序，所得序列在GenBank（http∶// www. ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中進行在線比對，序列同源性大于99%設(shè)為相同種。

2 結(jié)果與分析

2.1超聲波協(xié)同流水處理對克氏原螯蝦中菌落總數(shù)的影響

由圖1A可知，蝦殼+肉中的菌落總數(shù)為6.64（lg（CFU/g）），由圖1B、1C可知，腮部和腸腺中的菌落總數(shù)顯著高于蝦殼+肉，達到7.18、7.22（lg（CFU/g）），總體帶菌水平略低于李明彥[15]測定的結(jié)果（7.63～8.43（lg（CFU/g））），可能與蝦來源與養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。通過流水凈化（處理組1）可以顯著降低不同部位的細菌含量，處理12 h后的蝦殼肉、腮部和腸腺中菌落總數(shù)比起始值分別降低了0.59、1.05、0.44（lg（CFU/g）），腮中的細菌在流水中比其他部位容易去除。超聲波處理能夠顯著促進凈化過程中的細菌減除，在2 h超聲處理120 s（處理組2），蝦殼+肉、腮部和腸腺中最終菌落總數(shù)比起始值分別降低了1.71、2.11、0.84（lg（CFU/g））；處理組3在2 h和6 h各超聲處理120 s，最終菌落總數(shù)分別降低了2.18、2.23、1.01（lg（CFU/g）），處理組2和3中克氏原螯蝦的最終菌落總數(shù)水平均極顯著低于未加超聲波的處理組1（P＜0.01），結(jié)果表明超聲波協(xié)同流水處理對克氏原螯蝦的蝦殼+肉和腮部具有良好的減菌效果。蝦死亡率是評價凈化工藝的重要指標(biāo)[8-9]，本實驗中在凈化中使用兩次超聲處理（間隔4 h，持續(xù)120 s），凈化結(jié)束后未出現(xiàn)克氏原螯蝦死亡，活力與未處理組也無明顯差別，表明在凈化中加入適當(dāng)超聲波處理是可行的。

圖1 活體克氏原螯蝦在流水協(xié)同超聲波凈化過程中菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes in total aerobic colony number in live crawfish during the purification process

2.2細菌分離

根據(jù)1.3.4節(jié)方法，共分離獲得218個分離株，其中凈化前分離菌落蝦殼+肉部分52個（編號為KR1-1～KR1-52），腮部分61個（編號為TS1-1～TS1-61）；凈化后分離菌落蝦殼+肉部分49個（編號為KR3-1～KR3-49），腮部分56個（編號為TS3-1～TS3-56），所有菌落通過劃線純化后保種。

2.3指紋圖譜結(jié)果

將所有分離株提取基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物OD260nm/OD280nm在1.86～2.28之間，定量結(jié)果顯示DNA質(zhì)量濃度在157～475 ?g/mL，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明DNA完整，沒有斷裂和降解現(xiàn)象。以100 ng DNA作為模板進行RAPD指紋圖譜擴增，共獲得21個不同的指紋圖譜模式（A～U），表明所采用的隨機引物AP31和建立的體系具有較好的分型效率?？耸显r中主要好氧和兼性厭氧菌群顯示較高的分子多樣性，按不同指紋圖譜的相似性進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，在Nei’s遺傳距離50%處可以明顯分成5簇：Ⅰ（28%，包括A、B和N）；Ⅱ（27%，包括H、O、R、Q、T、K和J）；Ⅲ（27%，包括L、U、M和P）；Ⅳ（1%，包括C）；Ⅴ（17%，包括D、G、I、S、E和F）。其中指紋圖譜為N、P和J的菌株占47.7%，是克氏原螯蝦中的優(yōu)勢菌群。RAPD技術(shù)快速、廉價、簡便，在微生物分子生態(tài)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用[16]，但分型效率與隨機引物序列密切相關(guān)，隨機引物AP31在前期研究中顯示了良好的種內(nèi)分型能力[17]，本研究結(jié)果表明常規(guī)培養(yǎng)結(jié)合AP31建立的RAPD體系可以實現(xiàn)克氏原螯蝦中菌群構(gòu)成的快速分析。

圖2 細菌RAPD指紋圖譜擴增及聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis of RAPD patterns of bacterial isolates

2.4 16S rDNA測序鑒定結(jié)果

研究表明RAPD指紋圖譜可以應(yīng)用于鑒別種內(nèi)差異[18]，因此本研究將具有相同指紋圖譜模式的菌株認為具有相同種屬，選取代表菌株進行16S rDNA測序鑒定，結(jié)果應(yīng)用引物8F和15R及建立的PCR方法能夠順利擴增出產(chǎn)物，片段大小為1 500 bp左右，將擴增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果進行在線比對，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明21個譜型的細菌屬于9個屬18個種，其中不動桿菌屬（Acinetobactersp.）包括A型和B型菌株；氣單胞菌屬（Aeromonassp.）包括R、H、T、Q和O型菌株；芽孢桿菌屬（Bacillussp.）包括C型菌株；腸桿菌屬（Enterobactersp.）包括J型菌株；黃桿菌屬（Flavobacteriumsp.）包括N型菌株；假單胞菌屬（Pseudomonassp.）包括E和F型菌株；嗜冷桿菌屬（Psychrobactersp.）包括D、G、I和S型菌株；希瓦氏菌屬（Shewanellasp.）包括M、L、U和P型菌株；K型菌株屬于叢毛單胞菌屬（Comamonas jiangduensis）。Scott等[2]研究表明41%的淡水龍蝦血淋巴中攜帶不動桿菌屬、氣單胞菌屬、節(jié)細菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬的細菌，本研究中共分離9個屬細菌，其中的5個屬與Scott等研究一致，表明這些細菌是克氏原螯蝦普遍攜帶的菌群，另外分離到的4個屬（腸桿菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬、叢毛單胞菌屬）可能與本地克氏原螯蝦的養(yǎng)殖水體環(huán)境有關(guān)。

表1 不同基因型細菌分離株的16S rDNA測序鑒定結(jié)果Table1 16S rDNA sequencing identification results for different genotypes of bacterial isolates

2.5細菌種群變化

結(jié)合菌株指紋圖譜的分布和測序鑒定結(jié)果，對超聲波協(xié)同流水處理前后克氏原螯蝦攜帶菌群的構(gòu)成進行分析，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示超過50%的種群在凈化以后不能被檢測到，表明超聲波協(xié)同流水處理極大地減少了蝦殼肉和腮中攜帶的細菌種群數(shù)量，在蝦殼+肉部分，起始菌群中包括13個RAPD譜型，凈化以后能檢測到的只有6個RAPD型，分別屬于Pseudomonas putida、Psychrobacter glacincola、Shewanella baltica、Flavobacterium granuli、Shewanella putrefaciens、Aeromonas sobria6個種。在克氏原螯蝦的腮部起始菌群極具多樣性，能夠檢出18個RAPD型，凈化以后只能檢測到9個RAPD型，分別屬于Aeromonas piscicola、Aeromonas sobria、Aeromonas hydrophila、Pseudomonas putida、Psychrobacter glacincola、Enterobacter cloacae、Flavobacterium granuli、Shewanella putrefaciens8 個種，其中Aeromonas sobria、Enterobacter cloacae、Flavobacterium granuli和Shewanella putrefaciens是凈化以后克氏原螯蝦中殘留的優(yōu)勢種群，這4種細菌廣泛分布于土壤和水體環(huán)境中，是魚類等水生動物疾病的重要病原菌[19-20]，但對龍蝦的致病性尚未見報道，其中Aeromonas sobria和Enterobacter cloacae能夠產(chǎn)生毒素并對人類具有致病性[21-24]，F(xiàn)lavobacterium granuli和Shewanella putrefaciens水產(chǎn)食品的重要腐敗菌[20,25]，尤其Shewanella putrefaciens冷藏水產(chǎn)類的主要腐敗菌，其腐敗活性強，在低溫和低氧條件下能夠代謝產(chǎn)生腐敗效應(yīng)[26]，在克氏原螯蝦及其產(chǎn)品加工中應(yīng)該針對這4種細菌采取抑菌措施，確保產(chǎn)品安全和衛(wèi)生。

表2 超聲波協(xié)同流水凈化對克氏原螯蝦菌群構(gòu)成的影響Table2 Effect of ultrasonic and running water treatments on bacterial community composition of crawfish

3 結(jié) 論

克氏原螯蝦攜帶高水平的好氧和兼性好氧細菌，殼+肉部分攜帶量為6.64（lg（CFU/g）），腮部和腸腺中達到7.18、7.22（lg（CFU/g）），流水凈化可以降低克氏原螯蝦中的細菌載量，處理12 h后，腮部細菌總數(shù)降低最多，達到1.05（lg（CFU/g））。超聲波處理能夠顯著促進流水凈化過程中的細菌減少，兩次超聲處理使蝦殼肉、腮部和腸道中細菌載量最終降低2.18、2.23、1.01（lg（CFU/g）），表明超聲波協(xié)同流水處理對活克氏原螯蝦的蝦殼+肉和腮部具有良好的減菌效果。

克氏原螯蝦攜帶菌群構(gòu)成具有高度種屬和分子多樣性，主要包括不動桿菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬以及Comamonas屬，其中氣單胞菌屬、黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬和腸桿菌屬細菌為優(yōu)勢菌群。超聲處理協(xié)同流水凈化能有效降低蝦殼肉和腮部攜帶的好氧和兼性好氧細菌種群數(shù)量，50%以上的種群在凈化以后不能被檢測到，但溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、黃桿菌（Flavobacterium granuli）和腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）仍然是凈化以后克氏原螯蝦中殘留的優(yōu)勢種群，在后期加工中可以針對這4個屬種細菌采取抑菌措施。

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Effect of Synergistic Purification with Ultrasonic and Running Water on Bacterial Load and Microflora in Crawfish (Procambarus clarkii)

YANG Zhenquan, ZHOU Haibo, GAO Lu, RAO Shengqi, YIN Yongqi, FANG Weiming
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Objective∶ To examine the effect of synergistic purification with ultrasonic and running water on bacterial quantity and community composition in live crawfish (Procambarus clarkii). Methods∶ The bacterial colony numbers in the unshelled meat, grills and intestinal parts of crawfish were determined during the purification process and changes in bacterial community composition were analyzed using random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprint technique combined with 16S rDNA sequencing identification.Results∶ The purification procedure by ultrasonic combined with running water significantly reduced the bacterial loads in the unshelled meat, grills and intestine of crawfish to 2.18, 2.23 and 1.01 (lg (CFU/g)), respectively. A total of 218 single colonies were collected from bacterial counting plates, fingerprint patterns of 21 colonies of which were obtained through RAPD analysis. The 16S rDNA sequencing identification showed that the isolates with different fingerprint patterns belonged to 9 bacterial genera including 18 species, among whichAeromonassp.,Flavobacteriumsp.,Pseudomonassp.,Shewanellasp. andEnterobactersp. were the predominant bacterial groups for crawfish shell, meat and gills. After being purified with ultrasonic and running water, the remaining bacterial groups were reduced to 9 species from 6 genera, among which,Aeromonas sobria,Enterobacter cloacae,Flavobacterium granuliandShewanella putrefacienswere the major residual bacteria species. Conclusion∶ The synergistic purification with ultrasonic and running water is highly effective in reducing bacterial level and species in live crawfish.

Procambarus clarkii; purification; ultrasonic; microflora

S986.1

1002-6630（2015）17-0173-06

10.7506/spkx1002-6630-201517033

2014-11-24

蘇北科技發(fā)展計劃項目（BC2013438）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013733）；江蘇省青藍工程資助項目

楊振泉（1975—），男，副教授，博士，主要從事食品微生物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：yangzq@yzu.edu.cn